磁性纳米颗粒固定纤维素酶和产酶丝状真菌转化的研究分析化学专业论文.docxVIP

‘0-l‘‘tI【l■■■■■■●IL ‘0-l‘‘tI【l■■■■■■●IL on on magnetic nanoparticles and construction of genetic transformation system for cellulolytic filamentous fungi by Liao Hongdong B．S．(Xi’an Jiaotong University)2004 M．S．(Xiangtan University)1 994 A dissertation submitted in partial satisfaction of the Requirements for the degree of Doctor of Science in Analytical Chemistry in the Graduate School of Hunan University Supervisor Professor LIU Xuanming September，20 1 0 导下独立进行研究所取，本论文不包含任何其 导下独立进行研究所取 ，本论文不包含任何其 他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果 由本人承担。 作者签名： 蓠痧杳、 日期：2,,olo年／p月乡p日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查 阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本学位论文属于 l、保密口，在 年解密后适用本授权书。 2、不保密团。 (请在以上相应方框内打“√’) 作者签名： 日期：矽，夕年，厶，月夕D日 导师签名： 吨岛市沙 日期：∥rD年，9月乡蚤日 ～殍。∥ 乡^●●l 、Ⅳ=-，IlI-^J 磁性纳米颗粒固定纤维素酶和产酶丝状真菌转化的研究摘 磁性纳米颗粒固定纤维素酶和产酶丝状真菌转化的研究 摘 要 纤维素酶是一组具有纤维素降解能力酶的总称，它们协同作用可以将纤维素 物质水解成简单糖，进而发酵产生乙醇，从而应用于农业、再生能源以及环境保 护等领域。将已商业化的分泌型木霉生产的多组分纤维素酶有效固定化，不仅可 以提高酶的稳定性、重复性，降低应用成本，还能为其他大分子底物的多酶体系 的合理共固定研究奠定基础。本研究主要开展磁性纳米颗粒固定化纤维素酶和丝 状真菌转化系统研究，获得了以下主要研究结果： 一、以Fe203纳米颗粒和聚乙烯醇为载体物理交联固定纤维素酶方法的建立。 采以Fe203纳米颗粒为载体，以聚乙烯醇为包覆物和交联物对纤维素酶进行反复 冻融固定，形成了催化性质稳定的固定化复合物。采用透射电镜、红外光谱仪、 振动样品磁强度计对固定化酶复合体进行了表征，结果显示：固定化酶凝胶团由 大小约l pm的微凝胶团组成，微胶团内含10 nm左右的Fe203纳米颗粒。对影响 固定化因素的研究发现：当pH为6，固定化时间为11 h，纤维素酶／PVA为4， PVA／Fe为50时，固定化纤维素酶效果最高。通过该方法固定后酶活回收率达42％， 经过5次反应后的固定化酶相对酶活力仍保留50％以上。结果表明：基于Fe203 纳米颗粒和聚乙烯醇为载体的反复冻融法可以有效固定纤维素酶。 二、以牛血清蛋白(BSA)为模式蛋白，建立了采用硅油／Span80微乳体系固定 化蛋白质的方法，并探讨了pH对固定化蛋白质在复合物空间分布的影响。对制 备的BSA／PVA／Fe203纳米颗粒复合物进行酶联免疫、粒径、蛋白质含量分析， 结果表明：较高pH值(pH--5、6)有利于BSA分布在复合物表层，而较低pH值 (pH=3、4)使BSA则更多地镶嵌在复合物内层。透射电镜、zeta电位、红外光谱 分析的结果显示BSA／PVA／Fe203纳米颗粒复合物粒径分布都较为均匀，具有球型 核壳状的立体结构，并较好地保持了BSA的活力。 三、利用硅油／Span80微乳体系对纤维素酶(ICM)进行了固定，考察了油相种 类、油水比、纤维素酶浓度，搅拌转速，pH值，交联方式等因素对固定化纤维素 酶活力的影响。结果显示：采用硅油／Span 80体系，水／油比值为1／25，水相纤维 素酶浓度为20 mg·mL～，搅拌转速为2000 rpm，pH值为5的条件下固定化效果 最佳。滤纸酶活力可达7 U·mg一。透射电镜和粒径分析表明该固定化酶的粒径为 300 nm左右，并形成Fe203纳米颗粒聚集在内，高分子物质分布在外的复合物。 振动样品强度分