PCR反应程序对土壤微生物PCR-DGGE分析影响.PDFVIP

— ４８— 江苏农业科学　２０１８年第４６卷第２１期 武丽娟，陈月星，刘小凤，等．ＰＣＲ反应程序对土壤微生物ＰＣＲ－ＤＧＧＥ分析的影响［Ｊ］．江苏农业科学，２０１８，４６（２１）：４８－５２． ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０１８．２１．０１１ ＰＣＲ反应程序对土壤微生物ＰＣＲ－ＤＧＧＥ分析的影响 １ ２ １ １ １ １ 武丽娟 ，陈月星 ，刘小凤 ，宋　月 ，张战凤 ，樊永亮 （１．西北农林科技大学植物保护学院，陕西杨凌７１２１００；２．西北农林科技大学农学院，陕西杨凌７１２１００） 　　摘要：利用聚合酶链式反应－变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）探讨不同ＰＣＲ反应程序（降落式ＰＣＲ、巢式－降 落式ＰＣＲ、普通ＰＣＲ、巢式ＰＣＲ）对土壤微生物ＰＣＲ－ＤＧＧＥ群落结构和种群多样性分析的影响。利用 ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ ４６２软件对ＤＧＧＥ指纹图谱进行数字化处理，并计算相应ＰＣＲ程序下ＤＧＧＥ图谱的多样性指数、丰富度指数、均匀 度指数和不同反应程序下图谱的戴斯系数，应用ＳＰＳＳ１６．０软件对相关指数进行方差分析，检测不同反应程序间各指 数的差异显著性。不同ＰＣＲ反应程序在土壤微生物ＰＣＲ－ＤＧＧＥ分析时，其群落结构和种群多样性指数间存在明显 差异。单纯应用降落式ＰＣＲ虽然提高了扩增的特异性，却降低了扩增效率，其 ＤＧＧＥ图谱丰富度较低，多样性较差， 与其他反应程序的ＤＧＧＥ图谱相似度较低；普通ＰＣＲ反应的ＤＧＧＥ图谱多样性和丰富度较高，与２种巢式ＰＣＲ相似， 然而由于普通ＰＣＲ在复杂模板情况下容易发生错配，难以保证扩增特异性，因而夸大样品中微生物种群多样性，与２种 巢式ＰＣＲ的ＤＧＧＥ图谱相似度较低。２种巢式ＰＣＲ反应程序下的ＤＧＧＥ图谱条带丰富，多样性高，群落结构相似度高， 能比较全面和科学地反映样品中微生物群落结构和种群多样性。因此，在利用ＰＣＲ－ＤＧＧＥ分析土壤微生物群落结构 和种群多样性时，采用巢式ＰＣＲ（包括巢式ＰＣＲ和巢式－降落式ＰＣＲ）比较合适。研究ＰＣＲ反应程序对土壤微生物 ＰＣＲ－ＤＧＧＥ分析的影响，可为ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术在土壤微生物群落结构和多样性分析中的应用和完善提供理论依据。 　　关键词：土壤微生物；群落结构；种群多样性；ＰＣＲ－ＤＧＧＥ；ＰＣＲ反应程序 　　中图分类号：Ｓ１５４．３　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００２－１３０２（２０１８）２１－００４８－０４ 　　土壤微生物是陆地生态系统中重要的组成部分，积极参 节，以１６ＳｒＤＮＡ基因Ｖ３区片段扩增为例，比较４种不同的 与土壤养分循环、有机质分解及肥力形成等重要的生态过 ＰＣＲ反应程序对土壤微生物 ＰＣＲ－ＤＧＧＥ多样性分析的影 ［１］ 程 。它们的生存很容易受到很多环境因子的影响，如污染 响，从而评价和筛选出适合于土壤微生物多样性 ＰＣＲ－ 物、地表植被、土地利用方式、土壤类型等，因此常常被认为是 ＤＧＧＥ分析的反应程序，以期为ＰＣＲ－ＤＧＧＥ技术在土壤微 土壤生态系统变化的指示者。除了对与土壤微生物密切相关 生物群落结构和种群多样性分析中的应用和完善提供理论基础。 的土壤酶和土壤微生物量的研究外，近年来，对土壤微生物多 １　材料与方法 样性的研究密集起来，这主要得益于不依赖微生物培养的分 子生物学技术［脂肪酸甲酯／磷脂脂肪酸（ＦＡＭＥ／ＰＬＦＡ）、扩 １．１　主要试验仪器和试剂 增的ｒＤＮＡ限制性分析（ＡＲＤＲＡ）、随机扩增多态性 ＤＮＡ 仪器：基因扩增仪（美国伯乐公司），涡旋仪、水浴锅、高 （ＲＡＰＤ）、末端限制性片段长度多态性（Ｔ－ＲＦＬＰ）、肠杆菌重 速冷冻离心机（德国艾本德生命科学公司），核酸突变检测系 复基因间一致序列 ＰＣＲ（ＥＲＩＣ－ＰＣＲ）、单链构象多态性 统（美国伯乐公司），核酸电泳仪（美国伯乐公司），凝胶成像 （ＳＳＣＰ）、１６ＳｒＤＮＡ序列分析］的发展和ＤＮＡ测序技术的日 系统（美国伯乐公司），蓝盾 ６２１可