对白血病化疗药物左旋天冬酰胺酶ⅱ的热稳定性改造以及微小残留白血病dna疫苗的构建纯化和免疫效果研究生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

北京协和医学院医学生物学tof5Z,所博I：tOf究生学位论义论文独创性声明 北京协和医学院医学生物学tof5Z,所博I：tOf究生学位论义 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果． 论文中除了特另ODil以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它结构 已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡 献均已在论文中作了明确的声明并表示了谢意。 作者签名：—— 日期： 论文使用授权声明 本人完全了解中国协和医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可 以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印，缩印或其它复制手段保 存论文，保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：—— 导师：—— 日期：—— 北京协和医学院医学生物学研究所博一l：研究生学位论文摘 北京协和医学院医学生物学研究所博一l：研究生学位论文 摘 要 在治疗急性淋巴细胞白血病的临床实践中有两个长期困扰人们的难题：一个 是化疗药物的副作用问题；另一个是导致白血病完全缓解后又不断复发的肿瘤细 胞微小残留问题。本课题针对这两个问题进行了初步的探索。 在急性淋巴细胞白血病的化疗方案中，左旋大肠杆菌天冬酰胺酶II是重要 的药物组成部分。但是该酶具有较大的副作用，同时由于其相对较短的半衰期和 热不稳定性，使得该药在实际治疗中需要进行频繁地注射，结果使病人产生了更 大的痛苦。因此在本研究课题中对如何提高该酶的热稳定性以便进一步提高其半 衰期进行了初步研究：通过生物信息学分析手段确定了天冬酰胺酶蛋白质二级结 构中一个与热稳定性关系密切的B．转角，并用定点突变的方法将该转角上的第 178位的天冬氨酸突变为脯氨酸。实验结果显示：与野生型酶相比，突变体酶在 不同温度条件下的热稳定性得到了提高；从能量角度上看，改造后的酶在保持动 力学性质(Km和‰)基本不变的同时活化能得到了增加。这说明笔者对左旋 天冬酰胺酶的改造在不影响酶活性的前提下提高了其热稳定性。 对于化疗和骨髓移植不能彻底解决的白血病细胞微小残留问题，本课题对相 应的免疫学解决方案进行了探索。虽然肿瘤细胞疫苗在目前来说是一种较有前景 的免疫治疗形式，但出于对其安全性方面考虑，笔者决定尝试用另外一种相对安 全的免疫形式——DNA疫苗，来治疗微小残留白血病，并对其免疫效果进行了 初步研究。本课题采用双质粒系统，其中一个质粒表达经过改造灭活的肿瘤细胞 特异性超表达抗原生存素(survivin)和能特异性引起Thl细胞免疫反应的发夹 状单链RNA(ssRNA)：另一个质粒表达细胞因子GM．CSF和共刺激分子CD80。 结果证明用该DNA疫苗系统免疫BalB／C小鼠能引起较强的细胞免疫应答，诱 导较强的T细胞增殖和对肿瘤细胞的CTL杀伤活力。这些结果为进一步研究 DNA疫苗对微小残留白血病的实际治疗提供了前期实验室数据基础。 DNA疫苗大规模纯化技术的研发是DNA疫苗走向实际临床应用和工业化 生产的必不可少的环节。本课题重点对利用排阻层析纯化质粒的技术进行了研 究。笔者对不同种类及不同浓度盐缓冲液存在时，各种核酸分子排阻层析行为的 变化进行了观察比较。结果显示：在高浓度中性盐存在情况下，不仅是RNA， 4 北京协和医学院医学生物学研究所博．IOf歹u生学位论文其它的核酸分子包括宿主基因组DNA和各种质粒同分异构体的层析分辨率都得 北京协和医学院医学生物学研究所博．IOf歹u生学位论文 其它的核酸分子包括宿主基因组DNA和各种质粒同分异构体的层析分辨率都得 到了较大提高。进一步探讨深层机制，笔者认为在这一高盐排阻层析纯化过程中 同时存在两种分离模式：1、超螺旋质粒DNA主要受到压缩效应的影响以排阻 模式被洗脱；2、RNA和宿主基因组DNA则主要受疏水效应的影响从而以相互 作用模式被洗脱。我们的实验结果证明使用高浓度(2 M)的中性盐(硫酸铵) 将提高排阻层析纯化DNA疫苗的效率。 关键词：急性淋巴细胞白血病；左旋大肠杆菌天冬酰胺酶II；热稳定性；微小残 留白血病；DNA疫苗；排阻层析；中性盐。 Abstract In the treatments of acute lymphoblastic leukaemia,there arc two problems puzzling people all alone：One is the side—effects caused by chemotherapy；and another is the minimal residual leukaemia which leads to the relapse of cured patient． The present study has dong some re