ube2v1及ube2v2调节肝癌细胞生长转移及其分子机制的研究肿瘤学专业论文.docxVIP

硕士学位论文和UBE2V2肝癌中的发生发展中的作用进行研究。 硕士学位论文 和UBE2V2肝癌中的发生发展中的作用进行研究。 目的： 1．检测UBE2V1和UBE2V2在正常肝细胞和肝癌细胞中的表达量。 2．构建高表达UBE2V1和UBE2V2的肝癌稳定细胞株。 3．探索UBE2V1和UBE2V2在肝癌细胞体内外生长转移方面具有的生物学 作用。 4．研究UBE2V1和UBE2V2影响肝癌细胞生长和转移的机制。 方法： 1。提取细胞的RNA，逆转录为cDNA后作为模板，在特异性的上下游引物 作用下，用PCR法获得目的基因。经PCR和双酶切后，连接到慢病毒表达载体 LV5中，得到重组质粒LV5．UBE2V1和LV5一UBE2V2，测序正确后委托公司包装 得到重组慢病毒颗粒。重组病毒感染肝癌细胞。感染后的细胞采用嘌呤霉素筛 选1周，Western Blot验证表达后进行扩大培养、冻存，用于后续实验。 2．将稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株以相等的数量 接种于24孔板，每隔24h用CCK8法检测不同组的肝癌细胞的增殖状况并绘制 生长曲线； 3．将稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株以相等的数量 接种于6孔板，经过约半个月的常规培养后，用平板克隆形成实验检测细胞的 体外克隆形成能力； 4．将稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株以相等的数量 接种于6孔板，过夜后用枪头在铺满孔板的细胞中划出一道相同宽度的划痕， 用培养基冲洗后换为无血清培养基，在相同时间内测量实验组和对照组细胞爬 过划痕的距离并比较，以此测量细胞的迁移能力。 5．在Transwell上室接种相同数量稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株 及其对照细胞株，在相同的时间内，检测细胞穿过膜的数量，通过Transwell实 验检查重组细胞的迁移能力。 6．在Transwell上室铺一层基质胶，然后在Transwell上室接种相同数量稳 万方数据 摘要定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株，在相同的时间内，检测 摘要 定表达UBE2V1和UBE2V2肝癌细胞株及其对照细胞株，在相同的时间内，检测 细胞穿过膜的数量，以此检测重组细胞的侵袭能力。 7．在裸鼠前肢两侧腋下皮下接种相等数量的稳定表达UBE2V1和UBE2V2肝 癌细胞株及其对照细胞株，观察记录两组细胞瘤体的生长情况并绘制生长曲线， 并用免疫组织化学的方法分析两组瘤体中ki67和actived．Caspase 3的表达。 8．通过尾静脉向裸鼠体内注射相同数量的重组肝癌细胞和对照组细胞株， 构建肝癌转移模型，同时用小动物活体成像实验检测UBE2V1和UBE2V2对肝癌 细胞在体内转移的影响。 9．用蛋白免疫印记检测重组稳定肝癌细胞株中p-AKT和p．ERK的表达量， 以检测UBE2V1和UBE2V2在体外促进肝癌细胞转移的机制。 10．用免疫组织化学法检测重组稳定肝癌细胞株形成的瘤体中c．myc、 UBE2V1、UBE2V2、caspase3、ki67、p-AKT和p．ERK的表达量，以检测UBE2VI 和UBE2V2在体内瘤体中的表达及促进肝癌细胞生长和转移的机制。 结果： 1．成功构建了高效表达UBE2V1和UBE2V2的慢病毒载体，包装成慢病毒颗 粒后感染肝癌细胞系SMMC一7721、QSG一7701和Hep3B细胞。经嘌呤霉素进行压力 筛选后， Western Blot检测结果表明感染细胞中uBE2v1和uBE2v2的表达量明显 增高，提示成功构建稳定表达UBE2V1和UBE2V2的肝癌细胞。 2．采用CCK8法检测稳定高表达UBE2V1和UBE2V2的SMMC．7721、O．SG一7701 和Hep3B细胞和相应对照细胞的增殖情况，结果显示高表达UBE2V1和UBE2V2对 细胞体外增殖无显著影响(PO．05)，结果无统计学意义。 3．克隆形成实验显示高表达uBE2V1和uBE2V2的稳定细胞株，其克隆形成能 力和对照组，亦无明显改变(PO．05)，结果无统计学意义。 4．细胞划痕实验结果显示，稳定高表达UBE2V1和UBE2V2的肝癌细胞株在相 同时间内爬过划痕的距离远远大于对照组细胞株(PO．05)，提示：稳定高表达 UBE2V1和UBE2V2能在体外明显促进肝癌细胞的迁移。 5．Transwell迁移实验结果显示，稳定高表达UBE2Vl和UBE2V2的肝癌细胞株 万方数据 硕士学位论文在相同时间内穿过transwell膜的细胞数远远大于对照组细胞株(Po。05)，提示： 硕士学位论文 在相同时间内穿过transwell膜的细胞数远远大于对照组细胞株(Po。05)，提示： 稳定高表达UBE2V1和UBE2V2能在体外明显