粗毛栓菌漆酶的生化和分子生物学研究遗传学专业论文.docxVIP

四川大学博：b学位论文粗毛栓菌漆酶同工酶的生化和分子生物学研究 四川大学博：b学位论文 粗毛栓菌漆酶同工酶的生化和分子生物学研究 专业 遗待学 博士生董佳里 指导教师张义正教授 摘要 利用RB亮蓝平板检测方法发现，粗毛栓菌(Trametes gallica)有较强的漆 酶产生能力，其显色反应明显强于黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)。 对液体培养条件下粗毛栓菌产生漆酶的研究表明，2％以下的胰蛋白胨能明 显促进漆酶的产生：高碳(1％葡萄糖)条件下产生的漆酶明显高于低碳条件： 高浓度铜离子(200mamaol／L)能有效促进该菌漆酶的产生：胰蛋白胨．葡萄糖培 养基(TG)和细菌用蛋白胨．2％葡萄糖培养基(PG)产生的漆酶活性最高。 研究了59种芳香类化合物对粗毛栓菌漆酶产生的影响，发现27种对漆酶 产生有促进作用，其中对苯二酚作用最强；另外32种化合物在不同程度上抑制 漆酶的产生，对硝基苯酚和2，6．二氯苯酚的抑制作用最强：不同取代基化合物、 同分异构体化合物对漆酶产生表现出一定规律性，其中对位、邻位和问位的芳 香化合物的促进产酶作用按对位问位邻位捧列。 用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳活性染色法研究了12种培养基对粗毛栓菌漆 酶同工酶谱的影响。结果表明，不同培养基产生不同的漆酶同工酶谱。其中在 振荡培养条件下，马铃薯提取物．酒石酸铵．葡萄糖培养基(PAG)和氨基酸混合 物-酒石酸铵一葡萄糖培养基(AAG)均可产生多达14条漆酶同工酶谱带，而在 静置培养下的PAG I培养基产生的同工酶带仅为4条。综合各种培养条件，粗 毛栓菌产生的漆酶同工酶数目高达20种，是迄今发现产生漆酶种类最多的一种 真菌。 通过硫酸铵沉淀，DEAE．sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析，Sephadcx X 四川大学博士学位论文G一100凝胶过滤层析和改进的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(1N．PAGE)等方法， 四川大学博士学位论文 G一100凝胶过滤层析和改进的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(1N．PAGE)等方法， 从粗毛栓菌(r gallica)分泌的胞外蛋白中分离了14种漆酶同工酶(依次命名 为Lael至Lael4)，纯化产物通过SDS—PAGE电泳检查，均已经达到了电泳纯。 生物物理性质测定表明，纯化的漆酶同工酶分子量都是60，000Da (SDS)，并且为单体：多糖含量为10～13．5％：每个蛋白质分子含有4 个铜离子；具有610am典型I型铜离子的的蓝色吸收，以及330nm弱的II型铜 离子的特征吸收；等电点在2．8～5．3之间；它们的非变性凝胶迁移率却各不相 同。 生化性质测定显示，在pH6～10的范围内，漆酶是比较稳定的；最适反应 温度为70。C，但pH值可严重影响其热稳定性；金属离子对漆酶活性有一定程 度的抑制，其中Fe2+的作用最强。在试验的几种抑制剂中，NaN3抑制作用最强； 对ABTS、DMP和愈创木酚最适反应pH值依次为2．2，3．0和4．O；K．m值测定 表明ABTS是最适底物，但纯化的14种漆酶的Km值存在很大差异。 漆酶能够有效氧化多种芳香、非芳香化合物以及偶氮染料和生物活性染料： 对20种有机化合物最适反应pH值为2．2～5．4之间；通过测定耗氧速率，ABTS 仍是漆酶最适反应底物。 漆酶Lael0和Lacll的N．末端的氨基酸序列测定结果分别为： A．I．G-P-v．A-D．L．T．I．S-N和S／A．I．G-P．V诅．D-LoI．S-N。同源性分析显示，2 种漆酶N-端氨基酸序列与栓菌属的其它菌株的漆酶N一端序列有较高的同源性。 根据漆酶基因序列的保守性设计了多对简并引物，通过PCR方法从粗毛栓 菌基因组DNA中克隆到3个DNA片段：lac9147，lac9201和k9450；采用 RT-PCR方法克隆到2个333bp的eDNA片段：lace333a和lacc333b以及1个 长1488bp的eDNA片段lacA。 对6个漆酶基因片段的核苷酸及其编码的氨基酸序列进行同源性分析，结 果表明lac9147与lac9450完全相同，它们应是来自同一个基因；该基因与 lacc333a同源性很高，达98．9％。此外，lacA和lace333b之间也有较高同源性 达99．3％；lac9201与其它5个DNA序列同源性相对较低。因此推测6个DNA 片段可能来自5个不同的漆酶基因。 lacA序歹4编码由496个氨基酸残基组成的漆酶，结构中含有漆酶特有的3 种类型的c一结合位点，4个N．糖基化位点以及2个二硫键位点。同源性分析 Xl 列川丈学博上学位论文结果显示，该eDNA序列出与其它生物的漆酶基因有较高的同源性，但差异也 列川丈学博上学位论文 结果显示，该eDNA序列出与其它生物的漆酶基因有较高