对鞘翅目害虫有活性bt菌株的筛选及cry8ea2基因的克隆表达和活性研究农业昆虫与害虫防治专业论文.docxVIP

摘要苏云金芽胞杆菌(Bacillus砌“一n廊绝凼，简称Bt)是目前研究最深入的杀虫微生物， 摘要 苏云金芽胞杆菌(Bacillus砌“一n廊绝凼，简称Bt)是目前研究最深入的杀虫微生物， 其杀虫蛋白基因也是应用最广泛和最有发展潜力的抗虫基因，因此，深入发掘Bt新菌 株、分离克隆新型的杀虫基因对害虫的防治具有重要意义。近年来，鞘翅目害虫尤其是 金龟甲科害虫的危害日趋严重，由于其幼虫生活在土壤中，给防治带来很大的困难，本 研究从山东省土壤中分离Bt菌株，结合本室保存的菌株，利用PCR．RFLP鉴定体系对 其进行基因型鉴定，在此基础上分离克隆对金龟甲科害虫有效的新型杀虫蛋白基因，研 究该基因的表达和杀虫活性，为构建高效广谱的Bt工程菌和培育转基因抗虫植物提供 新型基因资源。本研究的主要内容和结果如下： 1本试验从山东省各地采集土样750份，采用芽孢杆菌选择性培养基与晶体染色相 结合的方法从中分离出Bt菌57株，Bt菌株的平均分出率为7．60％，这些Bt菌株的晶 体形态包括菱形、方形、圆形和不规则形等形状。 2利用已设计的保守区通用引物S5un8／S3un8和S5un3／S3un3对本试验分离的和本 室保存的菌株进行PCR扩增，对所鉴定的菌株中B—DLL和B．JJX菌株扩增出阳性片段， 说明B．DLL和B．JJX菌株中含有cry8类基因，SDS．PAGE分析表明B．DLL和B—JJX 菌株的杀虫晶体蛋白主要为130 kD。 3杀虫活性测定结果表明菌株B．DLL在浓度为6．0x108 cfu／mL时对暗黑鳃金龟和琉 璃弧丽金龟一龄幼虫14天的校正死亡率分别为26．67％、33．33％；对柳蓝叶甲96小时 的校正死亡率为33．33％；菌株B．JJX在浓度为6．0x108 cfu／mL时对柳蓝叶甲96小时的 校正死亡率为30．80％，对其它几种试虫没有活性。 4以菌株B．DLL质粒为模板，对GenBank中公布的cry8类基因进行分析，设计了 一对cry8类特异性引物JJX5和JJX3，PCR扩增出3．5 kb的目的片段，将其克隆到载体 pBluescriptSK(+)，经测序分析表明，该基因的编码框由3495个碱基组成，编码的蛋 白质由1164个氨基酸残基组成。通过比较，该基因编码的氨基酸序列与Cry8Eal的氨 基酸序列同源性最高达99．31％，其中在第452、526、527、537、542、752、907和975 位等8个氨基酸不同。该基因的核苷酸序列已经在GenBank登录(Accession number： EU047597)，提交国际Bt．6．内毒素命名委员会并被确认为一个新的杀虫蛋白基因，正 式命名为cry8Ea2。 5将cry8Ea2基因插入到大肠杆菌表达载体pET．21b(+)中，构建了T7启动子控 5将cry8Ea2基因插入到大肠杆菌表达载体pET．21b(+)中，构建了T7启动子控 制的大肠杆菌重组表达质粒pET21b．cry8Ea，再将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经IPTG诱导，SDS．PAGE分析表明该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中能够 正常表达130 kD的蛋白。 6 Cry8Ea2表达产物杀虫活性测定结果表明，该蛋白对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟 和柳蓝叶甲等幼虫具有杀虫活性，在浓度为8．98)tg／g土时对暗黑鳃金龟、琉璃弧丽金龟 一龄幼虫14天的校正死亡率分别为46．67％、55．56％；在浓度为89．8／ag／mL时对柳蓝叶 甲三龄幼虫96小时的校正死亡率为33．33％。而对华北大黑鳃金龟、茄二十八星瓢虫、 黄粉虫、棉铃虫、甜菜夜蛾、粘虫、粉纹夜蛾等幼虫均未发现有活性。 关键词：Bt；菌株分离；cry8Ea2基因；基因克隆；鞘翅目害虫；杀虫活性 Screening Screening of B．thuringiensis Strains against Coleopteran pest and Cloning, Expression and Insecticidal Activity of cry8Ea2 Gene Author：Xinglong Liu Supervisor：．Prof．Guoxun Li， ，Prof．Changyou Li Major． Agriculture Entomology and Pest Control Abstract Bacillus thuringiensis(Bt)is the most in-depth study of microbial pathogens，and its insecticidal protein gene is the most widely and potentially used a