分子生物学试验课件.ppt

一、实验目的 掌握碱裂解法提取质粒的方法 二、实验原理 分离质粒DNA方法 碱变性法 煮沸法 SDS法 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化 碱变性法基本原理 在pH 12.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒DNA仍为自然状态 将PH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态，通过离心可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚氯仿抽提进一步纯化质粒DNA 三、实验材料 实验试剂 ＬＢ培养基： 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 定容 1000ml pH7.5 NaCl 10g ＳＴＥ： 0.1M NaCl 10mM Tris HCl(pH8.0) 1mM EDTA ＡｍＰ 50mg/ml 溶菌酶 10mg/ml (用10mM Tris·HCl pH8.0新鲜配制） 四、实验方法 １．挑取琼脂培养板上的单菌落至5ml LB培养液中（含AmP 50μg/ml）， ３７℃强烈摇荡过度 ２．取1.5ml培养液至Eppendorf管中，12000g离心30秒，弃上清，用１ml STE悬浮菌体，再离心回收菌体，并重复一次，弃上清，取沉淀 ３．将细菌沉淀悬浮于100μl预冷溶液Ⅰ中，振荡混匀，冰上放置5分钟 四、实验方法 ４．加入200μl溶液Ⅱ，盖严管盖轻柔颠倒以混匀内容物，冰上放置5分钟 ５．加入150μl溶液Ⅲ，温和振荡数次，冰上放置５分钟 ６．12000g 4 ℃离心５分钟，取上清移到１个新的Eppendorf管中 ７．加入等体积酚/氯仿（１：１），振荡混匀，12000g 4 ℃离心２分钟。取上清移至另１个Eppendorf管中 ８．加入２倍体积无水乙醇，振荡混匀，于室温静置2分钟。 ９．12000g ,4 ℃离心５分钟。 10．弃上清，加入１ml 70%乙醇漂洗沉淀，盖严管盖颠倒数次，12000g 4 ℃离心２分钟。 11．弃上清，抽干乙醇，室温干燥（5-15分钟）。 12．加入50μl TE（含20μg/ml RNA 酶，不含DNA酶）溶解DNA。 13．取10μl DNA溶解液用ＴＥ稀释至1000ul测定OD260和OD280,计算OD260/OD2 80之比 14.同时以以下公式计算得率 质粒DNA得率： 稀释倍数×OD260×0.05×50/1.5ml 15．取10μl DNA溶解液加2μl Loading buffer于1%琼脂糖,电泳3小时,电压40伏。 16．电泳凝胶在透射式紫外检测仪上观察，记录结果 五、实验结果分析 １．根据质粒DNA OD260,OD280值，计算质粒DNA得率和DNA纯度 ２．记录电泳结果并说明结果内容 六、思考题 １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的作用，以及实验中 分别加入上述溶液后，反应体系出现的现象及其成因 ２．简要叙述酚氯仿抽提ＤＮＡ体系后出现的现象及其成因 实验二  实验目的 学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法 实验原理 感受态：细菌能够吸收外源DNA的生理状态称为感受态 细菌经低渗氯化钙处理后，细胞膨胀、细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过细胞的状态 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态 实验仪器 实验试剂 ? 大肠杆菌DH5α ? LB培养基， ? 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 实验步骤 菌株活化 感受态细胞制备 实验步骤 菌株活化 1．用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，在LB培养基平板表面划线，于37℃培养16小时 2．挑取一个单菌落，转到3－5mlLB培养基中，于37℃培养3－5小时 3．将培养液全部转到100mlLB培养基中培养2－3小时，到OD600＝0.3－0.4 实验三  实验目的 1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义 2.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法 转化 将外源 DNA 分子引入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术 常用转化方法 电击法 CaCl2、RuCl等化学试剂法 实验原理 本实验以 E.coli DH5α 菌株为受体细胞，用 CaCl