多肽壳聚糖纳米粒细胞转运机制及靶向性研究药剂学专业论文.docxVIP

目 目 录 一、摘要 1 (一)中文摘要 l (二)英文摘要 4 二、正文 8 (一)前言 8 (二)材料和方法 9 l实验材料 9 1．1仪器 9 1．2药品与试剂 l 0 1．3细胞株与动物 1 0 2方法 10 2．1多肽壳聚糖的制备 10 2．2多肽壳聚糖阿霉素纳米粒的制备及表征 12 2．3考察不同因素对于纳米粒细胞摄取的影响 14 2．4抑制剂法考察纳米粒的摄取机制 15 2．5体外纳米粒的靶向性考察 16 2．6体内纳米粒的靶向性考察 17 2．7统计学处理 17 (三)结果 17 1多肽偶联壳聚糖的结构鉴定 17 万方数据 1．1多肽壳聚糖红外光谱鉴定 1．1多肽壳聚糖红外光谱鉴定 17 1．2多肽壳聚糖的核磁鉴定 1 8 1．3多肽壳聚糖的制备优化及多肽的含量测定 o 6 19 2多肽壳聚糖阿霉素纳米粒的质量评价 20 2．1包封率和载药量的测定 20 2．2粒径、zeta电位及TEM形态图 21 2．3纳米粒的体外释放行为的考察 22 2．4 MTT法检测空白纳米粒载体毒性 24 3不同因素对于纳米粒摄取的影响 24 3．1细胞内阿霉素标准曲线的绘制 24 3．2时间因素的影响 25 3．3浓度因素的影响 26 3．4温度／能量因素的影响 27 4抑制剂法考察纳米粒的摄取机制 28 4．1抑制剂浓度的考察 28 4．2抑制剂法考察纳米粒的摄取机制 28 4．3激光共聚焦观察纳米粒的摄取情况 30 5体外纳米粒靶向性的考察 32 5．1 MTT法考察纳米粒对肿瘤细胞抑制 32 5．2肿瘤球抑制情况的考察 33 5．3肿瘤球渗透情况的考察 34 6体内纳米粒靶向性的考察 35 万方数据 6．1体重变化曲线 6．1体重变化曲线 35 6．2肿瘤抑制情况考察 36 (四)讨论 37 (五)结论 40 (六)参考文献 41 三、综述 43 (一)综述 43 (二)参考文献 59 四、攻读学位期间发表论文情况 71 五、致谢 72 万方数据 大连医科大学硕士学位论文多肽壳聚糖纳米粒细胞转运机制及靶向性研究 大连医科大学硕士学位论文 多肽壳聚糖纳米粒细胞转运机制及靶向性研究 硕士生姓名： 邓晨昕 指导教师： 范青教授 指导小组： 马辉程荔春赵辰阳 专业名称： 药剂学 摘要 目的：合成并优化制备多肽壳聚糖，制备多肽壳聚糖阿霉素纳米粒，进行质 量评价，考察体外释放度。并研究其细胞摄取机制及影响因素，考察纳米粒的体 内外靶向性 方法：1、通过两步反应合成多肽壳聚糖，第一步以谷胱甘肽为原料，通过 酰胺化反应合成中间产物巯基壳聚糖， 第二步通过多肽末端巯基与巯基壳聚糖末 端巯基进行二硫键反应将多肽偶联于壳聚糖上。红外光谱、核磁光谱对产物进行 表征， 荧光分光光度法测定多肽的偶联率。并改变各产物投药比对多肽壳聚糖的 合成进行优化。 2、通过离子交联法合成多肽壳聚糖阿霉素纳米粒，并通过包封、粒径、zeta 电位，透射电镜对纳米粒进行表征。MTT法检测空白载体的细胞毒性。透析法考 察不同pH条件下多肽壳聚糖阿霉素纳米粒的体外释药情况，并于各时间取样，高 效液相色谱法检测各组药物浓度，计算各组累计释放度。 3、纳米粒细胞摄取因素的考察。选取EGFR高表达的A43l细胞及受体低表 达的HepG2细胞，分别给予多肽壳聚糖阿霉素纳米粒(GEll．DOX—NP)、壳聚糖 阿霉素纳米粒(DOX—NP)及阿霉素溶液。考察时间、浓度、能量因素对细胞摄取 的影响。并通过高效液相色谱检测细胞内药物含量，BCA蛋白试剂盒检测细胞蛋 白浓度，胞内药物含量以每毫克蛋白含阿霉素药量表示。 4、纳米粒细胞摄取途径的考察。将FITC标记于多肽壳聚糖纳米粒上，并筛 选无毒剂量的各类抑制剂浓度，选取A431、HepG2细胞，在抑制剂阻断通路的情 万方数据 大连医科大学硕士学位论文况下，加入荧光标记的多肽壳聚糖纳米粒，以未加任何抑制剂处理的细胞作为对 大连医科大学硕士学位论文 况下，加入荧光标记的多肽壳聚糖纳米粒，以未加任何抑制剂处理的细胞作为对 照，通过流式细胞仪检测各组抑制剂的抑制效率，激光共聚焦观察纳米粒的胞内 分布及抑制后纳米粒的摄取情况。 5、多肽壳聚糖阿霉素纳米粒的体外靶向考察，选取A431、HepG2细胞，分 别给予不同浓度的GEll-DOX—NP、DOX—NP、阿霉素溶液，MTT法检测上述三种 制剂对肿瘤细胞的牛长抑制作用。建立A431的肿瘤球模型，分别给予上述三种 制剂，以未处理的肿瘤球做为对照组。每两天给药一次，并测定肿瘤球的长短径， 共给药6天，考察给药过程中上述三种制剂对于肿瘤球的抑制情况。建立A431的 肿瘤球模型，给予GEl 1-DOX—NP、DOX-NP，激光共聚焦观察肿瘤球对纳米粒的 摄取情况。 6、多肽壳聚