酵母蔗糖酶的制备与活力测定.docVIP

PAGE 1 PAGE 1 酵母中蔗糖酶的制备及活力测定 一、目的要求 1、学习一种酵母中蔗糖酶的制备方法。 2.掌握3,5-二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）测定酶活力的原理和方法。 3. 掌握还原糖测定的基本原理和721分光光度计的操作。 二、实验原理 蔗糖酶（invertase）（?—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的?—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。每水解1mol蔗糖，就生成2mol还原糖。还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸(DNS)则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在520nm波长下测定光密度(OD)值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖的含量。 酶活力单位的定义：在一定条件下，反应5分钟每产生1mg还原糖所需的酶量为一个活力单位（U）。 三、仪器与试剂 1. 仪器 研钵，天平，离心机，721型分光光度计，恒温水浴，具塞试管25ml，沸水浴，移液器（1000ul、200 ul） 2. 试剂 市售酵母干粉，石英砂，丙酮（预冷）, 1mg/ml葡萄糖溶液， pH4.5醋酸缓冲液, 10%蔗糖溶液，3,5-二硝基水杨酸溶液。 四、实验方法 1. 蔗糖酶制备 称取10g酵母干粉和少量石英砂放入研钵中，加适量蒸馏水，用力研磨30分钟成糊状，再加蒸馏水100ml，搅匀，6层纱布过滤，滤液加2倍体积冷丙酮搅匀，静置5分钟，离心管中，平衡后3000 rpm离心10 min，弃上清取沉淀。沉淀用2倍体积丙酮重复操作一次。沉淀真空干燥后称重。再称取25mg酶粉加入少量蒸馏水研磨5分钟，用蒸馏水定容至40ml作为酶应用液备用。 2. 蔗糖酶活力测定 （1）制作葡萄糖标准曲线 取7支具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准溶液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。按表1操作。 表1 数 量 管号 项目 0 1 2 3 4 5 6 葡萄糖标准溶液(ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 蒸馏水(ml) 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS 试剂(ml) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 沸水浴 5min 自来水冷却 蒸馏水(ml) 定容至25ml, 混匀，测定吸光度A520值 A520 将各管混匀，在沸水浴中准确加热5min取出，冷却至室温，用蒸馏水补足至25ml，加塞后颠倒混匀，在721分光光度计上进行比色。调波长为520nm，用0号管调零，分别测出1~6号管的吸光度A520值。以A520值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，绘制出标准曲线。 （2）蔗糖酶活力测定 取5支洁净25ml具塞试管，编号1、2、3、4、5。取1、2号试管按表2操作。 表2 试剂 1 2 10%蔗糖溶液(ml) 2.5 2.5 pH4.5醋酸缓冲液(ml) 2.5 2.5 0.4M氢氧化钠溶液(ml) 5.0 0 蔗糖酶液(ml) 1.0 1.0 准确反应5min 0.4M氢氧化钠溶液(ml) 0 5.00 蔗糖酶液加入后应立即混匀计时，准确反应5min后立即加入0.4M NaOH溶液混匀终止反应, 1号管作对照管。分别从1、2号管中吸取1.0ml反应液按表3操作 表3 试剂 3 4 5 反应液（ml） 1.0 1.0 0 蒸馏水（ml） 1.0 1.0 2.0 DNS 试剂(ml) 3.0 3.0 3.0 沸水浴 5min 自来水冷却 蒸馏水(ml) 定容至25ml, 混匀，测定吸光度A520值 A520 　 五、结果与讨论