分别表达鸡白细胞介素1β白细胞介素2和骨髓单核细胞生长因子基因重组鸡痘病毒的构建及其对nd疫苗免疫效力的影响预防兽医学专业论文.docxVIP

邵卫星：rFPVs表达的鸡IL．1 邵卫星：rFPVs表达的鸡IL．1 B、lL．2、IFN．Y或MGF对ND疫苗免疫效力影响 1 分别表达鸡白细胞介素1 B、白细胞介素2和骨髓 单核细胞生长因子基因重组鸡痘病毒的构建 及其对新城疫疫苗免疫效力的影晌 研究生：邵卫星 导师：刘秀梵教授 摘 要 在免疫反应发生部位，细胞因子微环境对抗原诱导免疫反应的质量和进程起 重要作用。细胞因子介导的免疫调节作用可在免疫反应的不同阶段进行，如抗原 提呈阶段：特异性免疫反应的效应阶段；免疫记忆反应建立阶段等。利用病毒载 体在体内表达细胞因予具有如下优点：可延长细胞因子在体内存在的时间；依赖 病毒的组织噬性，可使细胞因子到达特定部位；表达的重组细胞因子可保持更好 的生物活性。本研究克隆鸡的白细胞介素l 13(IL．1 13)、白细胞介素2(IL．2)和 骨髓单核细胞生长因子(MGF)的基因编码区；分别构建表达这3种细胞因子的 重组鸡痘病毒(rFPVs)．通过检测它们在体外表达重组细胞因子的生物活性，证 明rFPVs可以有效表达鸡IL．I 13、IL．2和MGF；以SPF鸡和商品鸡为动物模型， 研究rFPVs表达的鸡IL．1 0、IL．2、IFN．Y和MGF对新城疫常规疫茁(LaSota) 和基因工程疫苗(rFPv-HN)的免疫调节作用，探讨细胞因子发挥免疫佐剂作用的 机理，以期开发一种新型的疫苗佐剂。 l鸡IL．1 B、IL．2和MGF基因的克隆及序列分析 在无菌条件下取出4周龄的SPF鸡脾脏，分离单核淋巴细胞，用含有伴刀豆 蛋白(ConA)的培养液培养。分别在培养后的8h、24h、48h和72h收集脾淋巴细 胞，提取细胞总RNA，分离纯化mRNA。根据OenBank上登录的鸡IL．1 B(登 录号：Y15006)、IL．2(登录号：AF00631)和MGF(登录号：X14477)eDNA序 列，设计扩增鸡IL．1 B、IL．2和MOF基因编码区的上、下游引物，在下游引物特 异序列的5’端加上痘苗病毒转录终止信号的互补序列(AAA AAA AA)，用 RT-PCR方法扩增鸡的IL．1 B、IL．2和MGF基因编码区。PCR产物经凝胶电泳分 析，扩增出的鸡IL．1 B、IL．2和MGF基因编码区片段大小分别为804bp、432bp 和606bp，并且发现ConA刺激的脾细胞持续表达IL．1 B、IL一2和MGF的时间并 II II 扬州大学博士学位论文 不相同，其中表达IL．1 t3持续的时间最长，表达MGF持续时间最短。测得的序列 与已发表的序列进行比较，发现鸡IL．1 13有4个核苷酸和1个氨基酸发生了变化， IL．2有4个核苷酸和3个氨基酸发生了变化，而MGF的核苷酸和氨基酸没有发生 任何变化。这些位点的变化可能是同一种属不同品种间的正常变化，并不影响其 生物活性。 2分别表达鸡IL．1 B、IL．2和MGF基因重组鸡痘病毒的构建及其表达 产物生物活性的检测 将扩增的鸡IL．1 0、IL一2和MGF基因编码区(带有痘苗病毒转录终止信号的 互补序列)克隆到鸡痘病毒(FPV)转移载体p1175中，构建重组质粒p1175ILl B、p1175IL2和p1175MGF，使鸡IL．1 B、IL．2和MGF基因编码区紧处于痘苗病 毒早晚期启动子PE，L的下游。重组质粒p1175ILl B、p1175IL2和p1175MGF分别 转染已感染FPV疫苗株282E4的鸡胚成纤维细胞中(CEF)．与FPV 282E4抹发 生同源重组，通过蓝斑筛选和纯化，分别获得表达鸡IL-1 B、IL-2和MGF基因 的重组鸡痘病毒(rFPvs)rFPV．ILl 13、rFPV．IL2和rFPV-MGF。将获得的rFPVs 分别感染单层CEF，72h收获细胞培养上清，经0．19m滤膜除去其中的rFPVs；利 用X丁r／PMS法检测细胞上清中的重组细胞因子，效价分别为1．0x l矿U／ml、3．6 ×104U／ml、2．1 X 103U／ml，证明rFPVs可以很好地表达鸡IL一1 B、IL一2和MGF。 3 rFPVs表达的鸡IL．1 B、IL．2、IFN-Y和MGF对新城疫疫苗免疫效力 影响 用表达鸡IL．1 B、IL．2、IFN—Y和MGF的rFPVs(rFPV—ILl B、rFPV·IL2、rFPV— IFN Y和rFPV—MGF)接种不同日龄的SPF或商品鸡，同时免疫新城疫(ND)LaSota 疫苗或基因工程疫苗rFPV—HN，通过检测免疫后的体增