erp-9131总大肠杆菌多管发中酵技术.docVIP

方法91 31 总大肠杆菌(多管发酵技术) 1.0适用范围 l 1.1本方法用于测定地下水和地表水中存在的大肠杆菌类细菌。 | 1.2按本方法分析的大肠杆菌类细菌，其定义为：所有能于35℃在48h之内使乳糖 发酵，并产生气体的需氧的和兼性厌氧的、革兰氏染色阴性的、不形成孢子的杆状细菌。 2.0方法摘要 2.1多管发酵技术是一种分三步进行的试验方法。结果经统计处理以最可能数(MPN)表示。下面摘要介绍这三个步骤：假定试验、确信试验和完成试验(为了使分析结果准确，需要进行五管试验)。 2.1.1假定试验：用累进量的待测水样接种到一系列月桂酰胰蛋白液态培养基初步 发酵试管。将接种后的试管于35±0.5℃培养24±2h，检查试管内有无气体生成。继续培养无气体生成的试管。并在48±3h结束时再行检查。在48±3h内只要有气体生成，不论其量多少均为阳性假定试验。 I 2.1.2确信试验：在24和48h内显示有气体生成的所有初步发酵试管均应进行确信试验。用在假定试验中显示阳性结果的试管中的培养基，接种到含有亮绿乳糖胆汁液态培养基的发酵试管，气体生成后应尽快进行接种。将接种后的试管于35±0.5℃培养48±3h。在这段时间内的任何时刻有气体生成即表明为阳性确信试验。 2.1.3完成试验：在确信试验中显示阳性结果的所有水样均应进行完成试验。对分 析过的全部样品的20％进行完成试验，还可作为一种质量控制手段。在一个或数个伊红 亚甲蓝平皿琼脂上用待分析的样品画线。将画线后的平皿于35±0.5℃培养24±2h。培养 以后，将一个或数个典型菌落(即有菌落核心、具有或没有金属光泽)转移到月桂酰胰蛋白液态培养基发酵试管和营养琼脂斜面上。将发酵试管和琼脂斜面放于35±0.5℃培养24土2h；如无气体产生则继续培养至48±3h。对于有气体生成的发酵试管，取其相应的琼脂斜面做革兰氏染色，并用显微镜进行观察。如果在发酵试管内生成气体，并且在琼脂培养基上出现革兰氏阴性、不形成孢子的杆状细菌，则可认为完成试验令人满意，同时确认被分析的样品中存在大肠杆菌类细菌。 2.2关于本方法的详细内容，请见“水和废水标准检验法”和“环境监测的微生物学方法”。 3.O干扰 3.1细菌在水中的分布是无规律的。因此，为了获得足够的统计准确度，本方法要求进行五管试验。 3.2存在余氯或其它卤索可妨碍细菌作用的持续。为防止出现这种问题，应在无菌样品容器中入硫代硫酸钠。 3.3水样中含有高浓度铜、锌或其它重金属可使细菌中毒。只有在怀疑水样中存在重金属时才应加入螯合剂，例如乙二胺四醋酸(EDTA)。 3.4必须牢记，最可能数表为概率计算结果，因而其精密度必然较差。最可能数表包含23％的正系统误差，通常会导致数值偏高。增加所分析的同一采样点的样品数日，增加所检验的分取样品的数目，都能提高最可能数的精密度。 4.O仪器和设备 4.1培养箱。 4.1.1 培养箱内所有位置的温度在任何时间都必须保持均匀和稳定，即使用区域内的温差不得大于±0.5℃。为了达到这种恒温准确度，应使用带恒温水套的或无水型培养箱，培养箱配备绝缘良好的恒温控制低温电热装置，电热装置安装在恒温室四壁后面夹层中或底板下面，也可安装在其附近；最好配备机械装置用以循环空气。如果使用干热式培养箱，湿度必须保持在75％～80％ 4.1.2另外，也可使用保温良好，加热装置分布适当并配备强制空气循环装置的专用培养室，但其温差和相对湿度必须符合要求。使用这种培养室时，每天应记录培养平皿或试管处的温度范围。培养箱配备敞开露式金属丝架或板架，其问隔应能保证整个室内温度匀一。平皿架或试管筐与四壁应保持2.5cm问距。 4.1.3培养箱内每一个正在使用的架子上，应放置一支准确的温度计，其球部浸入液体(甘油、水或矿物油)；记录每天的温度数(最好是在早晨和下午读数)。另外，在培养箱内位于中间的一个架子上，最好放置一支带最高和最低温度记录的温度计，以便记录24h内的温度总范围。培养箱满载时，应定时测定箱内的温度变化。只要有可能，就应安装一支自记温度计，以便保留一份连续的、永久的温度记录。水银温度计的刻度应为0.5℃，每年应对照国家标准局(NBS)检定合格的温度计校准一次。刻度盘温度计应每 4.1.4水浴中的水应保持足够深，能没过试管内的培养基液面。 4.2干热灭菌箱。应使用尺寸足够大的干热灭菌箱，以防内部拥挤。灭菌箱的构造应能保证灭菌温度均匀并足够高(170±10℃)，应配备适用的温度计或温度记录仪表。 4.3高压灭菌器。 4.3.1应使用尺寸足够大的高压灭菌器，以防内部拥挤。灭菌器的构造应能保证灭菌