supcd28mab对foxp3egfp小鼠体内表达foxp3的treg细胞的扩增作用及对dss诱导结肠炎小鼠模型的治疗效果的研究内科学消化专业论文.docxVIP

复旦大学攻读硕士学位研究生毕业论文 复旦大学攻读硕士学位研究生毕业论文 中文摘要 中文摘要 SupCD28 MAb对Foxp3EGFP小鼠体内表达Foxp3的Treg细胞的扩 增作用及对DSS诱导结肠炎小鼠模型的治疗效果的研究 背景与目的： CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)为一类具有免疫抑制功能的独立的T 细胞群，约占外周CD4+T细胞的5％．10％，是机体维持自身免疫耐受的重要组成 部分。越来越多的研究证明这群T细胞在免疫病理、移植物耐受、阻止自身免疫 反应、肿瘤免疫和维持机体免疫平衡等方面发挥着重要作用。Superagonistic CD28．specific monoclonal antibody(CD28超协单克隆特异性抗体，supCD28 MAb， clone：D665)可以激活T细胞，并且选择性的扩增CD4+Foxp3+Treg细胞，从而增 强其在体内抑制炎症反应，调节自身免疫的作用。 已有研究表明CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞在IBD的发病中起着重要的 作用，缺乏Treg细胞的小鼠对肠道共生菌群产生高反应性，引起严重的自身免疫 性肠炎。而输注Treg细胞可以减轻SCIDdx鼠I由CD4+CD45RB川oHT细胞所诱导的 结肠炎。葡萄糖硫酸钠(Dextran Sodium Sulfate，DSS)诱导的结肠炎类似于人类 溃疡性结肠炎，是目前公认的研究IBD的动物模型。 本实验研究目的为：(1)通过supCD28 MAb腹腔注射后对Foxp3EGFP小鼠Treg 细胞的扩增作用以及对Foxp3，Thl，Th2分化途径相关细胞因子的影响的，以期阐述 单次注射supCD28 MAb后不仅在数量上扩增Treg，且通过不同的抗体标记，证明 扩增的Treg与体内原有I约Treg具有相同的功能。(2)通过supCD28 MAb腹腔注射 后对DSS诱导结肠炎小鼠模型的疗效观察，以期为IBD的治疗提供新的实验依据。 方法： 第一部分：30只Foxp3mFP小鼠随机分为正常对照组，supCD28 MAb注射1．4组， 每组6只。对照组不做处理，supCD28 MAb组给予一次腹腔注射supCD28 MAb lmg／只，1．4组分别于注射后第3天，第7天，第14天，第30天取脾脏，肠系膜淋 巴结，胸腺及外周静脉血的淋巴细胞，经抗CD4，CD62L，CDl03，CDl 52染色，于 流式细胞仪上进行分析比较各组Treg细胞的变化情况。各组小鼠脾脏取淋巴细 胞，提取RNA后，逆转录为eDNA，对Foxp3，IFN-7，TNF．Gt，IL一6，IL一10，TGF．p进行 实时定量PCR分析，比较各因子的变化情况。 第二部分：20只Foxp3EGFP小鼠随机分为空白对照组(n=6)、3．5％DSS组(n=6)、和 复旦大学攻读硕士学位研究生毕业论文 复旦大学攻读硕士学位研究生毕业论文 中文摘要 DSS模型supCD28 MAb给药组(n=8)。空白对照组给予蒸馏水自由饮用，3．5％DSS 组和给药组均予3．5％的DSS溶液自由饮用5天，给药组在饮用3．5％DSS第一天给 予腹腔注射supCD28 MAb lmg／只。每曰进行疾病活动标准(DAI)评分。第8天处 死所有小鼠，取结肠标本测量长度，做HE染色，行结肠病理学评分。模型组和 给药组取脾脏，肠系膜淋巴结，淋巴细胞进行抗CD4，CD62L，CD 1 03，CD 1 52染色， 于流式细胞仪上进行分析比较两组Treg细胞的变化情况。结肠，脾脏细胞提取 RNA后，逆转录为eDNA，对Foxp3，IFN吖，TNF．Q，IL．6，IL．10，TGF．13细胞因子进行 实时定量PCR分析，比较各因子的变化情况。 结果： 第一部分： 1．注射supCD28 MAb后第3天，小鼠脾脏、肠系膜淋巴结较对照组有显著增大， 而胸腺与对照组相比体积变化不大。小鼠脾脏及肠系膜淋巴结的 Foxp3+CD4+Treg细胞增加约3倍，外周lIILFoxp3+CD4+Treg细胞增加约2倍。胸腺 @Foxp3+CD4+Treg细胞在两组中没有显著差异。 2．肠系膜淋巴结中Foxp3+CD4+Treg细胞在注射后第3天达到顶峰，随后逐渐 下降，至第30天左右可恢复到接近对照组水平。脾脏及外周血中 Foxp3+CD4+Treg细胞在注射后第7天达到顶峰，随后逐渐下降，至第30天左 右可恢复到接近对照组水平。胸腺细胞中Foxp3+CD4+Treg细胞一直无显著增加 或减少。 3．脾脏及肠系膜淋巴结中CD4+CDl03+Foxp3+Treg细胞，CD4+CDl52+Foxp3+ Treg细胞，CD4+CD62L+Foxp3+Treg细胞在注射后第三天较对照组均显著增加， 倍数约5．