凝胶层析原理.ppt

柱床体积VT 凝胶干体积Vg 内水体积Vi 存在于柱床内凝胶外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中流动相的体积。 颗粒内部所含水相的体积它可从干凝胶颗粒重量和吸水重量相减求得。 凝胶体积以及颗粒内外间隙体积的总和。 VT = 1/4 ?D2h 外水体积V0 VT = Vg + V0 + Vi 数理关系 Ve –Vo Kd = ———— Vi 6、分配系数（ Kd ）： 特点： （1）与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔隙的大小有关 （2）与柱的长短粗细无关 每个溶质分子在流动相和固定相之间有一个特定的分配系数（Kd） Ve=Vo+KdVi (2)Ve = Vo + Vi Kd = 1 分子完全不被排阻 完全向凝胶颗粒内部扩散 在两相分配的比值为1,最后流出. (1)Ve = Vo Kd = 0 分子完全被排阻于凝胶颗粒之外 全部分布于流动相里, 最先流出。 (3) 0 Kd 1 Ve = Vo +ViKd 为溶质以某种程度向凝胶颗粒内扩散 Kd=0 0＜Kd1 Kd=1 洗脱体积 ?三.凝胶层析的优点 1.凝胶是一种不带电荷的惰性载体，结构稳定 2.操作条件较温和。 3.样品得率高,重复性好,可进行大量样品的分离纯化 四、凝胶层析的缺点 1.要求样品和洗脱液的粘度很低 2.凝胶颗粒网络孔径大小非常有限,所以可被纯化的物质的分子量范围受到限制 3.凝胶结构对某些溶质分子具有吸附作用 五、凝胶的结构与性能 1.葡聚糖凝胶 1959年Porath和Flodin合成 （商品名为Sephadex） （1）结构： 基本骨架：葡聚糖（dextran） 交联剂：3-氯代-1 ,2-环氧氯丙烷使葡聚糖之间通过醚键交联聚合而成的三维空间网状结构 （2）特点： 交联度： 交联剂越多 交联度越大 网孔结构越紧密 交联剂越少 交联度越小 网孔结构越疏松 化学性质： 稳定,不溶于水、盐、弱酸、碱和一般有机溶剂, 耐热耐碱不耐强酸 （2）特点： Sephadex的分级范围 G10 700 G15 1,500 G25 1,000-5,000 G-50 1,500-30,000 G-75 3,000-70,000 G100 4,000-150,000 G150 5,000-400,000 G200 5,000-800,000 吸水性 G类的型号 表示每克干凝胶吸水量（ml）x10 如G-50 每克干凝胶吸水量为5ml * * 小 结 名称 原理 电极缓冲液 支持介质 电泳形式 加样方式 染色液 分辨率 醋酸纤维素电泳 琼脂糖凝胶电泳 PAGE IEF SDS层 析CHROMATOGRAPHY 一、概述 1、定义 层析(又名色谱) 一种利用混合物中各组分的物理化学性质间的差异，使各组分在层析两相中以不同程度分配，借此将各组分分离。 分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力分子亲和力吸附能力 凝胶层析 离子交换层析 亲和层析 2、物理化学性质间的差异 吸附层析 L L ■ 层析分析法的基本原理： 流动相 Mobile phase 固定相 Stationary phase 样本分子依其分子极性 选择亲和两相之一 吸附层析 分配层析 Liquid - Solid Liquid - Liquid 两相系统 A B C 每次分离样本 都要做一次选择 One Plate of Separation (理论板数) S 极 性 L 非 极 性 极 性 非 极 性 样本 样本 1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带; 3、层析的发展 1931年，Kuhn采用柱色谱分离了类胡萝卜素 1941年，Martin和Synge提出分配色谱法 1944年，Martin等又提出纸色谱法 1952年，Martin和James发明了气液色谱法 1955年，第一台商品气相色谱问世，标志着现代 色谱分析的建立 1956年，Stahl系统研究了薄层色谱法(TLC) 1958年，Stein和Moore研制出氨基酸分析仪，确定了核糖核酸的分子结构 1967年，Horvvath和Huber等研制了高效液相色谱(high-performance liquid chromatography,HPLC)仪 1975年，Small等提出离子色谱?? ? 2