《SNT1109-2002-新城疫微量红细胞凝集抑制试验操作规程》.pdfVIP

新城疫微量红细胞凝集抑制 试验操作规程 Procedure of haemagglutination— inhibition test for Newcastle disease SN ／T 1109— 2002 前 言 本标准等效采用国际兽医局的标准《诊断方法和疫苗标准手册》(2000年，第四版)，并参考中华人民共和国进出境动物检疫规程手册编写、制 定。 本标准的附录A、附录B为标准的附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：胡永强、单松华。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 1 范围 本标准规定了禽类新城疫微量红细胞凝集抑制试验方法。 本标准适用于禽类新城疫红细胞凝集抑制抗体水平的检测。 2 引用标准 下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均为有效。所有标准都会被修订，使用本标准的 各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。 国际兽疫局《诊断方法和疫苗标准手册》(2000年，第四版) 3 仪器设备、试剂和材料 所有试剂均为分析纯。 3.1 器材 μ 普通天平、分析天平、普通离心机、V型血凝板、微型振荡器、50 L可调移液器、恒温箱、塑料采血管等。 3.2 试剂 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、葡萄糖、柠檬酸钠、蒸馏水。 3.3 稀释液 pH7.0或至pH7.4 0.01 mol ／L磷酸盐缓冲液(PBS)的配制(见附录A标准的附录)。 3.4 新城疫标准抗原 由指定单位供应，或用标准新城疫(ND)毒株尿囊腔接种9～11日龄无特定病原体(SPF)鸡胚，收集尿囊液灭活制备抗原。 3.5 1 1%鸡红细胞 采集SPF鸡或无新城疫血凝抑制抗体的成年鸡血，放入等量的阿氏液(见附录B标准的附录)中，用20倍体积的PBS洗涤3～4次，每次以2 000 r ／ min离心3～4 min，最后一次5 min，用PBS配成1％悬液。4℃保存悬液，在72 h内使用完。 3.6 血清 3.6.1 标准阳性／阴性血清：由指定单位供应。 3.6.2 被检血清：采、送的样品。 样品以1 000 r ／min离心5 min，吸出血清待用。若需较长时间保存血清，可置于4℃或— 20℃。 4 操作方法 4.1 微量血凝试验(见表1) μ 4.1.1 在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25 L PBS，共加四排。 μ μ μ 4.1.2 吸取一定倍数稀释的抗原25 L加于第1列孔，充分混合后移出25 L至第2列孔，依次类推做等量倍比稀释至第11列孔，第11列孔弃去25 L。 4.1.3 设立第12列孔为红细胞对照。 μ 4.1.4 每孔再加25 L PBS。 μ 4.1.5 每孔各加入1％鸡红细胞悬液25 L。 4.1.6 立即置微型振荡器上混合1 min，或手持血凝板绕圆圈混匀。 4.1.7 置37℃静置15 min～20 min，或室温(18℃～25℃)静置40 min左右，或4℃静置60 min(如果环境温度太高时)。 4.1.8 结果判定：期间观察数次，直至对照的红细胞全部沉淀(此时为一个圆点)。将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪珠样流挂，根据血凝图像判定结 果。HA效价高于211时可继续增加稀释的孔数。 以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度(红细胞无泪珠样流挂)，该血凝滴度代表了一个血凝单位，再根据初始稀释度计算抗原的 血凝单位。