GRP78、CHOP、TRB3在大鼠脑缺血再灌注损伤中的作用分析.pdfVIP

贵阳医学院2014 届硕士学位论文 （6 ）预染蛋白Marker （北京鼎国昌盛生物技术有限公司）； （7 ）PM Westen Midview 荧光 Marker （康为世纪生物技术有限公司）； （8 ）PVDF 膜（MILLIPORE ，美国）； （9 ）1.5M Tris-HCl ，PH 8.8 ，制作分离胶缓冲液（Bio-Rad ，美国）； （10）0.5M Tris-HCl ，PH 6.8 ，制作浓缩胶缓冲液（Bio-Rad ，美国）； 1.3 器材 （1）离心机（德国Eppendorf 公司产品）； （2 ）800 型离心机（江苏荣华仪器公司产品）； （3 ）Centrifuse 5810R 台式冰冻离心机（德国eppendorf 公司产品）； （4 ）DYCZ-40D 转移芯（北京市六一仪器厂）； （5 ）DYY-7C 电泳仪电源（北京市六一仪器厂）； （6 ）DYCZ-24 双垂直蛋白电泳仪（北京市六一仪器厂）； （7 ）酶标仪（德国Eppendorf 公司产品）； 1. 4 主要应用软件 SPSS17.0 统计软件 2 实验方法 2.1 动物分组 健康雄性SD 大鼠40 只，大鼠适应性喂养一周后随机分为：正常组、假手术组各5 只、 缺血再灌注6h 组、缺血再灌注24h 组、缺血再灌注48h 组，每组各10 只大鼠。 2.2 动物模型制作及标本采集 2.2.1 脑缺血再灌注动物模型复制： 参照改良Longa[16]线栓法制作大鼠局灶性大脑中动脉缺血再灌注损伤模型。 大鼠用10％水合氯醛按330 mg ／kg 腹腔注射麻醉。固定后，颈部正中切口，分 离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉。由颈外动脉残端起始部剪一小口，选用 头端烫圆的4-0 尼龙外科线置入，经颈总动脉分叉处进入颈内动脉，沿颈内动脉 推进至有阻力感即停止 （从颈总动脉与颈内动脉分叉处计算约插入18mm ），结 扎血管，即为缺血，2h 后退出尼龙线即为再灌注。对假手术组大鼠不插入尼龙 - 6 - 贵阳医学院2014 届硕士学位论文 线结扎血管，其他步骤同上。正常组不做任何处理。模型制作过程中缺血再灌注 6h、24h 组各死亡1 只，48h 组死亡2 只。 2.2.2 标本采集： 制模成功的 26 只大鼠分别于再灌注 6h 、24h 、48h 给予 10%水合氯醛 (400mg/kg)腹腔注射麻醉，0.9 ％NaCl 左心耳灌注。假手术组于手术后2 h 、正常 组于分组后进行麻醉、灌注。用于Westem-bloting 检测的大鼠取左侧大脑半球视 交叉至垂体柄之间的脑组织，迅速置于液氮中快速冷冻，然后放入-80 ℃冰箱中 保存待检测GRP78、CHOP 和TRB3 蛋白和mRNA 。 2.3 检测指标及方法 2.3.1 光镜下观察脑组织结构 10% 中性甲醛固定组织48h 以后，常规石蜡包埋切片行HE 染色。光镜下观 察脑组织病理变化，光镜下观察，缺血再灌注各组大鼠脑组织缺血侧皮质脑细胞 数量、组织间隙水肿程度。 2.3.2 TUNEL 检测脑细胞凋亡 （1） 取相应的组织切片常规脱蜡入水； （2 ） 滴加0.01M TBS 1 ∶200 新鲜稀释Proteinase K 37 ℃消化10min ； （3 ） 用抗体稀释液1 ∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，37℃反应30min，0.01M TBS 洗2min×3 次； （4 ）滴加抗体稀释液1 ∶100 稀释SABC, 37℃反应30min ，0.01M TBS 洗5min×4 次； （5 ） DAB 显色：1ml 蒸馏水，分别加入DAB 显色试剂盒中A 、B 、C 试剂各 一滴混匀，后加至标本片上，镜下控制显色时间，水洗。 （6 ） 苏木素轻度复染：0.01M TBS 洗，蒸馏水洗。脱水，透明，封片，显微镜 观察。 （7 ）取相应区域不重复随机选取6 个高倍视野，每个视野计数 100 个细胞。计 算阳性细胞率[ （阳性细胞数/计数细胞总数）×100%]。 - 7 - 贵阳医学院2014 届硕士学位论文 2.3.3