第十一章 核酸生物合成.pptVIP

2、电泳法（DNA限制酶切图谱分析）： 将重组体、原载体经限制性内切酶切割后， 进行电泳，据DNA片段大小与有无来区分载体 是否重组。 3、核酸杂交： 将“目的基因”标记作为探针，与吸附有菌 落DNA的滤膜一起温育，若菌落含有目的基 因，可与探针结合，经放射自显影可显示出来。 一、聚合酶链反应（PCR）的概念： PCR即是一种体外快速扩增特异DNA片段 的技术。它是在模板DNA、引物、4种dNTP 和缓冲液存在的条件下依赖耐热DNA聚合酶 的酶促循环合成反应。 循环反应分三步： （1）变性， （2）退火， （3）延伸。一般进行25~30次循环。在约二小 时内可扩增106 ~109倍 三 、聚合酶链反应 二、反应系统；模板、引物（上、下游引物）、 dNTP、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、绶冲 液等。 三、基本步骤： 〈一〉变性：约96℃，15S，模板解链。 〈二〉退火：约55℃，30S，引物与模板粘合。 〈三〉延伸：约72℃，1.5min，酶沿引物方向 催化新链合成。 最后一次循环的“延伸”时间为5min。 〈四〉电泳分离产物。 四、基因工程产品的开发与应用 〈一〉基因工程疫苗：生产乙型肝炎、甲型肝 炎疫苗等。 〈二〉生产激素类：胰岛素、生长素等 〈三〉细胞因子：由免疫细胞和基质细胞产生 的高活性、特异性强的调节蛋白。 如多种生长因子（GF）、肿瘤坏死因子 （TNF）、多种造血因子、干扰素等。 1、RNA聚合酶全酶辨认、结合到模板的启 动区在真核细胞还有一些特异调控DNA称顺式 调控元件，还有一些辩认DNA的蛋白质称反式 调控因子共同参与转录起始过程。 （一）转录的起始 2、解开DNA双链，形成“转录空泡”。 1）较早认为RNA聚合酶与DNA结合后，“挤 入”双螺旋结构之内，使DNA解链，不需 其他辅助因子。 目前认为拓扑酶II也参与作用，形成负超螺 旋，有利于转录。 2）解链的范围不大（10—20bp）——形成转 录空泡。 3、起动复合物形成，转录开始： 不需引物，RNA聚合酶在起始部位催化两 个核苷酸形成磷酸二酯键。第一个核苷酸 常为GTP，GTP与随后的NTP生成 PPPGPN′-OH，仍保留三磷酸鸟苷状态。 因此常把[RNA聚合酶全酶-DNA-PPPGPN′ -OH]称为转录的起始复合物。 4、б因子从全酶脱落，可重复利用。 1、核心酶沿着模板滑动，催化四种NTP按碱基配对原则生成长的核苷酸链，方向5′→3′。核心酶经过后，DNA双链复合为双螺旋，RNA链与模板分离。 2、因同一DNA上可多位点同时转录；又因DNA— DNA较DNA—RNA结构稳定，故RNA易被排斥分离，在电镜下，同一DNA模板上，长短不一的RNA链散开成羽毛状图形。 3、同时将转录过程形成的“酶-DNA-RNA”复合物称为转录复合物。 4、对于较长的mRNA，可一边转录、一 边与核糖体结合而开始“翻译”过程。 （二）转录的延长 DDRP（核心酶）在模板的“转录终止点”停顿，酶—模板分离， RNA脱落。 1、依赖ρ因子帮助： ρ因子帮助RNA聚合酶辩认终点并停止转录。ρ因子与RNA结合（主要与PolyC亲和力最大）→RNA-DNA杂化双链的短链变性→利于转录产物从转录复合物中释放。ρ因子有ATP酶与解链酶活性。 2、不依赖ρ因子 RNA产物形成特殊结构来终止转录。在近转录终止区，转录产物常出现多个“UUUU…..”结 构，在此结构之前，转录产物形成“发夹样”或“柄鼓泡”样结构，这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。 （三）转录终止 四、转录过程的抑制剂 无论原核或真核生物，初级转录产物都经过一定程度的修饰和加工才表现功能。 真核生物转录后加工修饰更复杂，故主要介绍真核生物。 （一）mRNA的转录后加工 1、首尾修饰 （1）5′端带帽：即GPPPmG。其功能：一 种翻译起始因子可和帽子结构结合，故与翻译过程有关。 （2）3′端接尾；即PolyA，一般100~200bp。 其功能：维持mRNA作为翻译模板活性， 增加mRNA稳定性。 五、转录后的加工 2、内部剪接 （1）断裂基