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NICPBP 禽流感实验室检测 淮安市三院 薛永 流感病毒从动物到人的传播 1997.5-12， 香港-A(H5N1)，6/18死亡。 1999，香港-A(H9N2,首次)， 2儿童， 无死亡。 2003.2，香港-A(H5N1)，1/2死亡。 2003.2，荷兰-A(H7N7)，农场爆发，结膜炎，1人死亡。 2003~2004，亚洲爆发 H5 ，人禽均有死亡病例 如何进行禽流感检测 ？ 了解病毒的特性 流感病毒及其致病 分型： 甲型 －中等至严重的疾病，最广泛，15个亚型。 - 所有年龄组 - 人类和其它动物（禽 图 1 图 2、马、猪、牛、狗类） 乙型 － 较轻微的流行，无亚型。 - 主要感染人类， 儿童为主 丙型 －人类轻微呼吸道疾病，猪是天然宿主之一。 - 不引起流行，小儿散发病型。 甲型流感病毒分子模式图 流感病毒的分子结构 节段，单链，负义RNA，包膜 球形或多形态（图），直径80-120nm 包膜：双层脂质膜，糖蛋白突起（HA, NA) 基质蛋白:M1-基质蛋白，M2-离子通道 核心(核壳体）：核糖核酸-核蛋白复合物(NP, PB1-2,PA)等。 流感病毒主要抗原蛋白 NP：核衣壳蛋白，主要结构蛋白，型特异性抗原。 M1：基质蛋白，型特异性抗原。 HA：血凝素蛋白，能特异性吸附RBC表面的唾液酸糖蛋白受体 →RBC凝集。易变异。 甲型的亚型划分主要依据(15个亚型)。 抗体：抑制血凝，中和病毒，主要保护性抗体。 NA：神经氨酸酶蛋白，亚型特异性 。C型无。易变异。 甲型的亚型划分主要依据（9个亚型） 。 抗体：不能中和病毒，能限制病毒繁殖。 禽流感病毒的主要检测流程和方法 标本的采集 标本的检测 病毒分离 核酸检测 血清学检测 抗原快速检测 实验室安全 采集临床标本 采集急性期和恢复期双份血清 快速诊断 病毒分离 RT-PCR HAI 或微量中和实验 试剂盒 （MDCK 或 EGG） 测序 CPE + HA + HAI (WHO FLU H5 KIT) 流感病毒实验室检测方法比较 标本的采集 一、标本的采集、包装和运送 1.标本种类 咽、鼻拭子或含漱液等 全血或血清 尸检标本 2.采集标本时间 咽、鼻拭子或含漱口液等标本在发病的1~3天内采集 急性期血清在发病后7日内采集，恢复期在发病后2~4天内采集 尸检标本尸检时采集（注意无菌） 3.标本的保存 所有标本在医院采集时立即分装，一式二份。鼻咽腔等病毒分离用标本应于低温保存，24小时内不能够送达的，应尽快置-70℃以下保存。如果无-70℃条件的需在血清需在-20℃冰箱中短暂保存，尽快递送 。血清标本-20℃以下保存。 二、标本的采集和处理 1．采样液 pH7.4 HANK氏平衡盐。 pH7.4的Eagle`s MEM培养液（不含谷氨酰胺，可适当加入0.5~1%的牛血清白蛋白）。 肉汤采样液，多应用于鸡胚接种法分离病毒。肉汤采样液对细胞有毒性作用，不适用于细胞培养法分离病毒。 pH7.4的100mmol/l PBS与等量甘油相混所制采洋液，多用于采集动物标本，应用于鸡胚接种法分离病毒，不适用于细胞培养法分离病毒。 2．标本采集 咽拭子：让患者先深咳嗽几下，然后将棉签头浸入采样液中（为了提高病毒分离率，可以不蘸采样液进行干采），然后用棉签擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁，拭子放入采样管(内含3~4ml采样液)，弃去尾柄。为了提高采样效率，可以对同一患者，采集咽拭子2~3次，分别放入采样管内。 含漱液：让患者先深咳嗽几下，用4.5~5ml采样液含漱咽部10~20秒，漱口液吐入无菌的杯子中，转倒回采样管内。 鼻拭子：将棉签轻轻插入鼻道内鼻腭处，停留片刻后缓慢转动退出。以同一拭子拭两侧鼻孔。将棉签头部浸入3~4ml采样液中，尾部弃去。 鼻咽抽取物：采集方法同耳鼻喉科的常规操作方法：电动吸引器+三通管+导管，三通