草酸青霉β葡萄糖苷酶的过表达及纤维素酶新调控位点的筛选生物工程专业论文.docxVIP

山东大学硕士学位论文2．1．3主要生化试剂和仪器 山东大学硕士学位论文 2．1．3主要生化试剂和仪器 一16 2．1．4草酸青霉基因组DNA的提取 16 2．1．5 B一葡萄糖苷酶过表达菌株的构建 一17 2．1．6 B一葡萄糖苷酶基因转录水平的测定 。21 2．1．7木质纤维素酶活力测定 ．．22 2．2结果与讨论 23 2．2．1草酸青霉114—2 B一葡萄糖苷酶的氨基酸序列分析 23 2．2．2 13-葡萄糖苷酶基因、抗性基因和启动子的克隆 一24 2．2．3 B一葡萄糖苷酶基因过表达盒的构建 一25 2．2．4过表达菌株的获得和验证 一25 2．2．5过表达菌株B一葡萄糖苷酶基因转录水平的检测 一26 2．2．6对木质纤维素酶活力的影响 ．．27 本章小结 ．．28 第三章黑曲霉D．葡萄糖苷酶基因在草酸青霉中的异源表达 一3l 3．1材料和方法 3l 3．1．1菌株、培养基和培养方法 ．．31 3．1．2常用缓冲液和储备液 ．．31 3．1．3高产B．葡萄糖苷酶菌株的构建 ．．32 3．1．4木质纤维素酶活测定 一33 3．1．5高产菌株发酵液中添加13-葡萄糖苷酶粗酶液实验 ．．33 3．2结果与讨论 34 3．2．1黑曲霉bgll基因过表达盒的构建 ．34 3．2．2过表达菌株的获得和验证 ．．34 3．2．3最优转化子筛选 ．．35 3．2．4糖化实验 ．．36 本章小结 一37 第四章草酸青霉JU—A10．T突变位点的系统分析 ．39 ii 万方数据 山东大学硕士学位论文4．1材料和方法 山东大学硕士学位论文 4．1材料和方法 39 4．1．1菌株、培养基和培养方法 ～39 4．1．2常用缓冲液和储备液 ．．40 4．1．3差异位点序列比对 ．．40 4．1．3突变位点敲除株的构建 ～4l 4．1．4纤维素平板表型分析 ．．44 4．1．5木质纤维素酶活力测定 ．．44 4．1．6不同碳源对A突变株的影响 ．45 4．1．7 A突变株纤维素酶基因的转录水平检测 ．．45 4．1．8 A区域在基因组上的高度保守性 ．．45 4．2结果与讨论 45 4．2．1突变位点敲除株的构建 45 4．2．3纤维素平板表型分析 ．．47 4．2．4木质纤维素酶活力测定 ．．48 4．2．5 A突变株纤维素酶基因的转录水平检测 ．．49 4．2．6不同碳源条件下A突变株的淀粉酶活 ．50 4．2．7 A区域的特殊性 一5 1 本章小结 53 论文创新性结果与展望 一55 参考文献 ．．57 攻读学位期间发表的学术论文 ．．65 致谢 66 万方数据 山东大学硕士学位论文摘要 山东大学硕士学位论文 摘要 矿物资源是不可再生能源，最近一二百年的疯狂开采和消耗使得能源危机 这一问题逐步受到重视，随之产生的环境恶化问题也越来越严重。探寻一种绿 色可再生能源来减少或替代对化石燃料的依赖，可以很好的解决这一问题。生 物质材料在自然界普遍存在并且具有可再生性，利用微生物分泌的木质纤维素 降解酶系将木质纤维素类生物质转化为液体燃料和高附加值的化学品，可以有 效的改善环境和缓解能源危机。草酸青霉能分泌完整的纤维素酶系，并且具有 较高的半纤维素酶活力，这些特点更有利于木质纤维素的降解。但是纤维素酶 的表达水平较低，使得其并没有得到广泛的应用，因此，如何对草酸青霉的纤 维素酶表达体系进行系统改造进而提高其产酶的表达效能是当前面临的主要问 题。所以，对纤维素酶系改造具有重要应用意义。 根据草酸青霉的全基因组序列信息和转录谱数据，我们分析草酸青霉中可 能存在11个不同的p．葡萄糖苷酶基因，其中包括6个胞内酶。由于这些p．葡萄 糖苷酶的酶学性质各不相同，导致产生的纤维寡糖和单糖的种类不同，因此， 对其它纤维素酶的表达调控产生不同的影响，并且在木质纤维素底物的降解体 系中发挥着不同的作用。我们对草酸青霉的B．葡萄糖苷酶分别过表达，分析他 们对草酸青霉分泌纤维素酶系的影响，筛选对纤维素酶分泌最具有促进作用的 基因，从而为草酸青霉的纤维素酶表达体系系统改造提供新的靶点。 由于以草酸青霉114．2为原始菌株构建的高产纤维素酶菌株，其分泌的D一 葡萄糖苷酶相比外切、内切纤维素酶其酶活比例相对偏低，而在这些突变株中， 进一步过表达B．葡萄糖苷酶有可能会对其高产纤维素酶的活性造成不利影响。 因此，我们设想另构建一株高产B一葡萄糖苷酶的菌株，并根据特定的降解底物 以及所需的多种纤维素酶和p一葡萄糖苷酶的配比，添加到高产菌株分泌的纤维 素酶系中进行配比，以弥补其B一葡萄糖苷酶组分的不足，从而优化生物质的降 解酶系结构，提高木质纤维素的糖化效率。由于黑曲霉的B．葡萄糖苷酶基因 吲』具有较高的比活力，因此，我们在草酸青霉高产纤维素酶的菌株中，过表 万方数据 山东大学硕士学位论