病原真菌学技术研究进展顾菊林.doc

PAGE PAGE 31 第九章 病原真菌学技术研究进展 第一节 常用分子生物学技术 分子生物学技术作为一种手段已广泛应用于感染性疾病的各个方面。它从上世纪50年代起步，经历了20多年的徘徊，到70年代以后，由于DNA重组技术、DNA合成与序列测定等技术的涌现及发展，促使该技术进入了一个全面发展的时代。目前所采用的技术手段主要有以下几种。 分子杂交 分子杂交技术其基本原理是根据两条同源单链核酸在一定的条件下（适宜的温度和离子浓度）发生按碱基配对形成双链的原理，通过将标记的核酸作为探针，与待测标本核酸进行杂交反应，即可观察到标本中核酸中相应的基因。用于检测的已知核酸片段叫做探针，为了便于示踪，必须将探针用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物为放射性核素和非放射性核素如生物素、荧光素、抗原及抗体等。 1．斑点杂交 系将样品DNA/RNA直接点在固相支持物（如硝酸纤维膜）上，然后用标记探针杂交检测，它的特点是简便、特异且敏感性高，在杂交技术中应用较为广泛。 2．膜上印迹杂交 它与斑点杂交不同之处是先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后采用印迹技术（如电转移）将分离的核酸片段转移到固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变，再用标记探针杂交。主要有以下几种：(1)Southern blot：DNA分子经限制性内切酶消化和琼脂糖凝胶电泳，将所得的DNA片段按分子量大小分离，放入碱性溶液使其变性，再将变性后单链DNA从凝胶中转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用标记的核酸探针与膜上的核酸片段进行杂交，最后洗去未杂交的游离探针分子，通过放射自显影等检测方法显示探针的位置。(2)Northern blot：一种经典的RNA分析法(用于组织细胞中总RNA或mRNA的定性和定量分析)，提取细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移至纤维膜上与探针杂交。主要观测各种基因如致病基因、耐药基因等转录产物量及其变化。(3)Western blot：这是一种将蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳，原位转印至膜，再进行免疫测定的技术。(4)原位杂交：是应用标记的已知核酸作为探针对细胞或组织切片中的核酸进行杂交并检测的技术。该方法特异性高，并可以准确定位。 二、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR） PCR是一种体外核酸扩增技术, 1985年由美国Mullis 博士发明，1993 年获诺贝尔化学奖。由于PCR 技术本身十分简单，却可以将数量很少的原始模板DNA 分子进行几何级数的倍增，能最大限度地满足科学家操作DNA 的要求，因此在其问世后的十多年里，PCR 技术得到了迅速发展。在经典PCR 基础上发展了RT-PCR、反向-PCR、锚定-PCR、原位-PCR、巢式-PCR、重组-PCR、定量-PCR 等。近年来，PCR 技术得到进一步发展，建立了一系列PCR 扩增新技术，如等温分支扩增法( isothermal ramification amplification method，RAM)、滚环扩增反应(rolling-circle amplification reactions，RCA)、超分支滚环扩增(HRCA)、等温核酸序列基础扩增( isothermal nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、分子信标实时-PCR (molecular beacons for real-time PCR) 和荧光探针实时定量-PCR (fluorescent real-time quantitative-PCR , FQ-PCR ) 等。 DNA指纹技术 1．限制性片段长度多态性分析(restricted fragment length polymorphism，RFLP) RFLP是利用限制性内切酶在特定的核苷酸序列上将双链DNA切割，然后进行凝胶电泳，依据片段大小不同将其分离开。由于不同生物个体核苷酸序列可能存在差异，酶切位点也会随之改变，因而产生的DNA片段长度呈现多态现象。传统的RFLP方法是指基因组DNA经限制性内切酶酶切，电泳分离后再结合Southern印迹杂交，应用该方法可以构建DNA指纹图，这种方法特异性及敏感性均较高。目前，RFLP已广泛用于基因突变分析、基因定位和遗传病基因的早期检测等方面。RFLP具有以下优点: ①在多种生物的各类DNA 中普通存在；②能稳定遗传，且杂合子呈共显性遗传；③只要有探针就可检测不同物种的同源DNA 分子的RFLP；④限制性内切酶的种类很多，可选择各种不同的限制性内切酶使RFLP充分表现出来，这些特点使RFLP成为一种十分重要的遗传标记。用随机克隆的DNA 探针可以检测到一定水平的RFLP变异，这