zhx2基因启动子甲基化在肝细胞癌中的研究病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

ZHX2基因启动子甲基化在肝细胞癌中的研究剂使甲基化的肿瘤抑制基因去甲基化，重新发挥抑制肿瘤的功能，就有可能成为 ZHX2基因启动子甲基化在肝细胞癌中的研究 剂使甲基化的肿瘤抑制基因去甲基化，重新发挥抑制肿瘤的功能，就有可能成为 一种新的肿瘤治疗途径。常见的甲基化抑制剂是胞苷类似物如5．杂氮．2．脱氧胞 苷(5．Aza．2．deoxycytidine，5Aza．dc)，其作用机制是与DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)共价结合，降低酶的生物活性。许多研究者成功地将 5Aza．dc运用在多个体外培养的肿瘤细胞株中，逆转了多个肿瘤抑制基因启动子 的甲基化状态，使不同的肿瘤抑制基因得以开放，进而有效地抑制了肿瘤的发展。 目前用于DNA甲基化检测的方法很多，有高效液相色谱法(Highperformance liquid chromatography，HPLC)、甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR， MSP)、基因测序、甲基化敏感性内切酶指纹法(Methylation．Sensitive Restriction Fingerprinting，MSRF)和细胞去甲基化培养等方法。这些方法分别能研究单一 基因的甲基化及筛选肿瘤相关的异常甲基化基因。 本文的目的在于筛选HCC相关的异常甲基化基因，并研究该基因异常甲基 化在HCC发生情况，再通过探讨启动子甲基化对基因表达的影响进而分析肿瘤 抑制基因静息的机制，为阐明HCC的发生、发展机制提供研究基础。全文共分 为四个部分： 一、 运用MSRF技术筛选肝细胞癌中异常甲基化基因 收集32例新鲜HCC组织，包括肿瘤组织及瘤旁5cm以外的肝组织，并收集 6例血管瘤或胆管结石旁正常肝组织，提取组织DNA，经过甲基化非敏感性内 切酶MseI单独消化或MseI和甲基化敏感的内切酶BstUI联合消化DNA，产物 分别经过2对随机引物(Bsl／18，Bsl2／13)PCR扩增，电泳显示HCC癌组织与 癌旁肝组织及正常肝组织相比有3条异常甲基化片段，长度分别为200bp、210bp 及300bp左右。其中200bp异常甲基化片段出现于3例病例中，210bp及300bp 异常甲基化出现于另外2例病例中。通过回收该异常甲基化片段，与T载体连 接，转化感受态大肠杆菌DH5 Ci，选取阳性克隆测序，将获取的序列与人类基 因文库进行类比分析，发现这3条异常甲基化片段分别与ZHX2(Zinc fingers and homeoboxes protein 2)、MEF2C(myocyte enhancer factor 2C，MADS box transcription enhancer polypeptide C)及p16基因启动子区存在高度同源性。 二、 肝细胞癌中ZHX2启动子甲基化的检测 将能筛选到ZHX2启动子异常甲基化的3例HCC癌组织及6例正常肝组织 ZHX2基因启动予甲基化在肝细胞癌中的研究DNA，经过亚硫酸盐修饰后，测序引物扩增，产物亚克隆于大肠杆菌DH5 ZHX2基因启动予甲基化在肝细胞癌中的研究 DNA，经过亚硫酸盐修饰后，测序引物扩增，产物亚克隆于大肠杆菌DH5 挑选阳性克隆测序，结果显示此3例HCC癌组织中ZHX2基因启动子区多个 CG二核苷酸序列存在甲基化，而正常肝组织则无。使用MSP检测32例HCC 癌、癌旁肝组织和6例正常肝组织中ZHX2基因启动子甲基化的发生情况，发 现在正常肝组织未检测到甲基化，32例癌旁肝组织中仅有5例存在甲基化 (15．6％)，而32例HCC癌组织中有15例(46．9％)存在甲基化，这15例存 在甲基化的患者其血清甲胎球蛋白(alpha—fetoprotein，AFP)值均25 ng／mL， 而血清AFP25 ng／mL者则未检测到甲基化；19例低级别HCC中有9例(47．4％) 发现存在甲基化，而13例高级别HCC中有6例(6／13，46．2％)可检测到甲基 化，两者差异无显著性(P0．05)；10例伴随转移的HCC中8例检测到甲基化， 高于无转移组(7／22，31．8％)。 三、 肝细胞癌中ZHX2基因mRNA与蛋白的表达 使用RT-PCR检测32例HCC癌组织及其癌旁肝组织、6例正常肝组织中 ZHX2mRNA扩增情况，结果显示6例正常肝组织中均可检测到ZHX2mRNA的 扩增，32例癌旁肝组织中20例(62．5％)能检测到ZHX2mRNA扩增，明显高 于HCC癌组织(11／32，34．4％)。19例低级别HCC中有7例(36．8％)呈阳性扩 增，13例高级别HCC中有4例(30．1％)呈阳性扩增，两者差异无显著性(胗0．05)。 血清AFP25 ng／mL的26例HCC中6(23．