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Precision genome engineering based on TALE 基于TALE的靶向基因修饰技术 ;报告纲要;报告纲要;我们研究一个生物的性状,最终都需要做一件事:改变基因,从必要性和充分性两方面阐明基因功能。
1)Loss function:降低基因或删除基因
Give function: 提高基因的表达
;生物学家的梦想:随心所欲地操作基因 ;5;报告纲要;TALE蛋白中间含有一个重复区域,该区域由33-35个氨基酸的重复单元组成。每个重复单元的氨基酸序列高度保守,但第12位和13位的两个氨基酸可变,称为重复单元可变的双氨基酸残基(RVD)。TALE单体通过RVD识别DNA靶点上的碱基,有如下一一对应关系:
NG = T, HD = C, NI = A, NN = G or A ,NH=G 。;Dong Deng et al., Science 5 January 2012 ,121:5670;2011年,把 C 端的转录激活子替换为 FokI 核酸内切酶,首次实现了 TALE
蛋白的人工改造,并显示具有良好的效果。;FokI核酸内切酶切割DNA无序列特异性,FokI通常需要以二聚体的形式发挥其切割DNA序列的功能:;11;切割后(细胞 DNA 损伤后)会启动两种修复机制过程,一种为末端非同源依赖的修复机制 (NHEJ),另一种是依赖同源重组的修复机制 (HDR):;13;14;报告纲要;三、TALENs的操作要点;目前,已发展的TALEN组装方法:
基于Golden Gate(GG)克隆的方法:
(1)基于PCR的GG法(GG-PCR)
通过 PCR 扩增 TALE 重复单元,用 IIS 型内切酶产生多种一一对应、特异匹配的粘性末端对。一次可以连接 4~6 个 TALE 重复单元。
(2)传统的基于质粒载体的GG法(GG-Vector)
基于质粒载体,用 IIS 型内切酶产生多种一一对应、特异匹配的粘性末端对。一次可以连接8~10 个 TALE 重复单元。 ;3. 基于连续克隆组装的方法:
(1)限制性酶切-连接法(Restriction enzyme and ligation,REAL)
普通的限制性内切酶与IIS型核酸内切酶相结合的逐步连接策略。
(2)单元组装法(Unit assembly,UA)
用同尾酶切割产生相同的粘性末端,逐步连接不同的重复单元。
(3)和idTALE一步酶切次序连接法
从天然的TALE蛋白中提取出以一个RVD和两个 RVD 为单元的片段,用
普通的限制性内切酶与 IIS 型核酸内切酶相结合进行逐步连接。
;19;FastTALETM连接TALEN;亚克隆到植物表达载体上;报告纲要;四、TALENs的应用;Activators ;TALE蛋白新功能;与ZFN相比,优势:
(1)TALEN结合DNA的方式更便于预测和设计;
(2)TALEN的构建更加方便、快捷,甚至能够实现大规模、高通量组装;
(3)TALEN的特异性比ZFN高,而毒性和脱靶(off-target)效应则比ZFN低。;报告纲要;五、未解决的问题;谢谢大家侧耳倾听!;Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/
CRISPR-associated (Cas) systems
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