猪常见病PCR检测程序.docVIP

猪病检测手nn Tttr II录 TOC \o 1-5 \h \z HYPERLINK \l bookmark0 \o Current Document \h 猪瘟RT-PCR检测程序 3 猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 5 高致病性猪繁殖与呼吸综合症RT-PCR检测程序 7 猪流行性乙型脑炎RT-PCR检测程序 9 猪伪狂犬病毒（PRV） PCR检测程序 11 猪细小病毒（PPV） PCR检测程序 13 猪圆环病毒II型（PCV2） PCR检测程序 15 HYPERLINK \l bookmark36 \o Current Document \h 细菌学检测程序 17 猪瘟RT-PCR检测程序 一、 病毒RNA的提取 1、 阳性对照RNA的提取 材料 冻T?猪瘟兔化弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。 方法 将1瓶猪瘟兔化弱毒冻干疫苗川1.5ml蒸憎水或PBS液稀禅JIJ 1ml RNase-free管分 装，每管500pl, ?20°C保存。取出冻存的猪瘟病毒，解冻后离心，取上清用于RNA的提取。 RNA提取按试剂盒说明进行，瑕后用50pl RNAase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。 2、 疑似病料RNA的提取 样品采集 采集病死或扑杀的猪，取血清、扁桃体、淋巴结（包括肺门、腹股沟和肠系膜淋 巴结）、肺脏、脾脏、肾脏、流产胎儿等组织病变与健康部交界处组织；待检活猪，川注射 器取血5ml, 4°C保存，送检（病料要新鲜，严禁反复冻融病料）。附：通常木乃伊胎不能作为检 测样品。对于新鲜流产的胎儿，可作为检测样品。对于流产日龄较早的胎儿，可取整个胎儿保存；如果是 晚期流产的胎儿，最好根据上述步骤，摘取相应纽织，保存送检。胎儿的保存方法同上。 组织样品处理 称取病变组织0.5g T研磨器中研磨，加入1.5ml PBS （PH7.2）继续研磨制 成1:3的组织匀浆液,转至1.5ml灭菌离心管中,8000r/min离心2min,取上清液用于RNA 的提取；全血样品处理：待血凝后取血清用于RNA的提取。 RNA提取 待检样品RNA的提取按试剂盒说明进行,瑕后用50pl RNAase-free水溶解RNA, 得到RNA溶液。 二、 RT-PCR 反应 1、 材料 RT试剂盒（东洋纺产品）、PCR试剂盒（天跟公司产品）。 引物序列：F： 5,-GACCTGGATGCGACTGACC-3,, 19bp , TM 为 61.88。 R： 5,-GCGGCGAGTTGTTCTGTTAG-3\ 20bp, TM 为 59.85。扩增的目的片段为 133bp。 2、 RT体系及反应程序： 名称 弱毒疫苗阳性对照 检测病料 RNase-Free 水 6pl 0 特界性卜-游引物 lpl 1M1 模板RNA 5pl llpl Total 12pl 12pl 置于PCR仪±65°C10min,立即冰浴5min?然后加入以下试剂: 变性后的RNA溶液 12pl 5xRT buffer 4pl dNTP mixture 2pl RNase Inhibitor 1M1 Rever TraACE 1M1 Total 20pl 按以卞程序反转录： K 42°C, 45min 2、99 °C, 5min 将 cDNA-20°C保存。 3、PCR反应体系及程序 ddH2O 7.5pl cDNA 3pl 上游引物 W1 下游引物 IM 2xMaster mix 12.5pl Total 25pl 反应程序: 1、 94°C, 3min 2、 95°C, 30sec x35cycles3、 56°C, 30sec x35cycles 4、 72°C, Imin 丿 5、 72°C, lOmin 三、电泳 用TAE电泳缓冲液配制1.8%的琼脂糖凝胶，100ml加入5卩1染色液。80V/70Ma电泳 40min观察结果，在阳性对照出现133bp条带、阴性对照无条带的情况下，检测样品如出现 133bp的条帶，判定为猪瘟病毒阳性。 一、 病毒RNA的提取 1、 阳性对照RNA的提取 材料 冻T PRRS弱毒疫苗、检测用病毒RNA提取试剂盒（天跟公司产品）。 方法 将1瓶PRRS弱毒冻干疫苗川2ml生理盐水或PBS液稀释,JIJ 1ml RNAase-free管分 装，每管200pl, -20°C保存。取出冻存的病毒，解冻后用于RNA的提取。RNA提取按试剂 盒说明进行，最后用50pl RNAase-free水溶解RNA,得到RNA溶液。 2、 疑似病料RNA的提取 样品采集 病死或扑杀猪，取病死或扑杀猪，取血清、淋巴结（包括肺门和腹股沟淋巴结）、 肺脏、脾脏、流产胎儿等病变明显部位与正常组织交替处组织（检测蓝耳病必须包括淋巴结