产核黄素枯草芽孢杆菌ribah基因在ccpa基因位点的表达生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

摘要重组枯草芽孢杆菌生产核黄素的技术是目前最先进的核黄素工业生产方法。 摘要 重组枯草芽孢杆菌生产核黄素的技术是目前最先进的核黄素工业生产方法。 构建高产核黄素的重组菌，关键问题之一是提高核黄素操纵子的表达水平。增加 核黄素操纵子的拷贝数，并采用强启动子表达，是解决这一问题的必由之路。而 常用技术手段是利用游离或整合型的表达质粒，在受体菌中表达核黄素操纵子。 本文研究了利用染色体上ccpA基因的表达元件，表达核黄素操纵子中ribAH基 冈，以探讨一种提高核黄素操纵子表达水平的简便、多效方法。 首先通过对ccpA基因表达元件进行序列分析和比对，发现其在多方面都非 常符合强启动子的特征；。ccpA基因编码全局调控蛋白CcpA，对200多个基因具 有调控作用，也从另一个角度证明其表达元件具有突出的表达能力。 以产核黄素重组茵丑．subtilis 24为出发菌株，对其recA基因的缺陷进行了恢 复，得到召。subtilis 24 Y1。然后利用lipA：：Cm片段和lipA：：Cm—recA)午段分别转化 B．subtilis24Y1，根据氯霉素抗性转化子出现频率，考察了B．subtilis24Y1的同 源重组能力。发靴．subtilis 24Y1几乎不能发生同源重组，而连接recA基因的同 源片段重组频率能够达到1 o．7。 通过重叠PCR扩增了一段带有点突变的ribAH基因，经转化且subtilis 24 YI，通过同源重组在r／bAH结构基因中引入了两个连续的终止密码子，得到ribAH 基因缺陷株且subtilis 24 Y3。其核黄素产量从1．8 g／L降低到0．49／L，菌落颜色 由黄色变为白色。该ribAH缺陷株作为在ccpA位点表达ribAH的受体茵，而菌 落颜色将成为方便的筛选标记。 采用重叠PCR拼接方法，将ccpA基因的启动子片段、ribAH结构基因、ccpA 的终止子片段，以及recA基因相连；连接片段转化B．subtilis 24 Y3，通过双交 换重组，得到了ccpA的结构基因被ribAH置换的B．subtilis 24 Y5。同时，还得 到了ccpA的结构基I天l被ribAH置换，ribAH基因点突变同时被恢复的B．subtilis 24 Y6。从丑subtilis 24 Y5茵落呈明显的黄色判断，ribAH结构基因被ccpA基因 的表达元件正确表达。结果说明，利用染色体上的非必须基因的表达元件，通过 简单的双交换重组进行结构基因置换，来表达目的基因，在技术上具有可行性、 简便性和多效性。 关键词： 枯草芽孢杆菌核黄素操纵子ccpA基因ribAH基因 同源重组 重叠PCR ABSTRACTGemc ABSTRACT Gemc reconstruction of Bacillus subtilbs has been applied successfully in riboflavin production and is becoming the preponderant method．In order to construct riboflavin-producing strain，the point is how to improve the expression of the rib operon，such as using a strong promtor to express the operon，or adding the copies of the operon．Expression plasmid,integration or not,is used to express the operon in the s廿ain．This paper invented simple，new method to express ribAH gene of the rib operon,which use ccpA expression elements to express r／bAH． At first,sequence analysis and comparison of ccpA showed strong promoter features．In the cell，ccpA gene—encodes global regulator protein CcpA,which regulates almost 200 genes．That is to say,the expression element of ccpA is likely tobe strong． Riboflavin producing strain B．subtilis 24 is reconstructed．RecA muta