基因表达谱研究技术发展与其在农业科学中应用.ppt

基因表达谱研究技术发展及其在农业科学中的应用 六. cDNA-AFLP的优点及缺点 反应条件严谨, 可靠性高, 重复性好 不需要预先知道序列信息 所需仪器设备简单 优点 cDNA-AFLP技术优点众多较为完善，但仍应注意的是内切酶（罕见切割酶，常见切割酶）和实验数据的分析。 缺点 4 基因表达系列分析技术 一、概述：SAGE技术 二、SAGE的发明及其基础 三、SAGE的原理 四、SAGE目前的应用领域 五、SAGE一般操作步骤 六、SAGE的优点及缺点 一、基因表达系列分析技术的概述 基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression,SAGE）是1995年由Veleulescu等建立的一种新的基因表达模式研究技术，它可以在整体水平上对细胞或组织中的大量转录本同时进行定量分析，而无论其是否为已知基因。 二. SAGE的发明及其基础 由Veleulescu于1995年创立 SAGE是一种快速分析基因表达信息的技术。 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 1）RT-PCR技术 2）DNA测序技术 3）酶切技术 三、SAGE的原理： 9—10 bp短标签(tag)是从一个转录本内分离得到，充分含有识别转录本的信息，因为10 bp(410)从理论上说已足够代表任何一个物种的转录产物，但其前提是假设生物体内的碱基序列是随机分布的；连接多个短标签，就能把多个tag集中到一个克隆中进行测序。 四.SAGE目前的应用领域 快速分析基因表达信息 转录图谱的构建 发现新基因和基因的新功能 五. SAGE一般操作步骤 生物体特定阶段组织或细胞中全部mRNA的制备双链cDNA 片段的酶切和人工接头的连接 cDNA的双链的合成 锚定酶酶切 cDNA片段与接头（Linker）的连接 标签酶酶切释放标签序列 连接形成双标签（Ditages） 目录 1 mRNA差异显示技术 2 抑制消减杂交技术 3 cDNA-AFLP技术 4 基因表达系列分析技术 5 微阵列技术 1 mRNA差异显示技术 一、概述：mRNA差异显示技术 二、DDRT-PCR的发明及其基础 三、mRNA差异显示技术的原理 四、DDRT-PCR目前的应用领域 五、DDRT-PCR一般操作步骤 六、DDRT-PCR的优点及缺点 一、mRNA差异显示技术的概述 mRNA差异显示技术(mRNA differential display PCR, mRNA DD-PCR)是由Peng Liang等人在1992年建立的筛选基因差异表达的有效方法。它是将mRNA逆转录技术和PCR技术相结合的一种RNA指纹图谱技术。每一种组织细胞(包括同一组织细胞经过不同的处理)都有其特异表达的不同于其他组织细胞的基因谱，即特异的RNA指纹图谱。 二. DDRT-PCR的发明及其基础 由Liang于1992年创立 是分离差异表达基因强有力的工具 在随后几年里， Liang等在技术方面做了大量改进，使技术更适用、更简便 基于RT-PCR理论，依赖于3种技术 1）RT-PCR技术 2）以特定引物进行的PCR技术 3）DNA电泳技术 三、mRNA差异显示技术的原理： mRNA差异显示技术的主要原理是利用cDNA反转录技术,PCR扩增和高分辨率聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，来显示PCR产物的差异。 5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ Poly(A) RNA 5’ T12MN 3’ 锚定引物 逆转录 5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ 3‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 变性 5’ M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ 3‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 退火 5‘ T12MN 3’锚定引物 寡核苷酸随机引物 3‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 延长 dNTP、Taq聚合酶 3‘ M N TTTTTTTTTTTT 5’ 5’ M’N’AAAAAAAAAAA 3’ 变性、退火、延伸 电泳 显示 T12MN(M为A、G、C，N为A、T、G、C) 启动cDNA第一链合成 不同长度的PCR产物 回收差异条带，再扩增，克隆测序，同源比对 随机结合到cDNA链上 四.DDRT-PCR目前的应用领域 基因表达差异 基因的鉴定与克隆 抗逆性机理的研究 探究激素调控机理 五. DDRT-PCR一般操作步骤 总RNA的提取与反转录 RT-PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳及差异DNA条带的回收 PCR在扩