磁珠寡核苷酸微阵列多重可扩增探针杂交技术的建立及在杜氏肌营养不良检测中的应用临床检验诊断学专业论文.docxVIP

中文摘要扩增探针组，与固定在磁珠上待测的基因组DNA杂交，并 中文摘要 扩增探针组，与固定在磁珠上待测的基因组DNA杂交，并 用磁珠回收特异性杂交的探针，回收的探针经扩增及荧光标 记后，与相应的寡核苷酸芯片杂交，数据分析，以达到检测 DMD外显子缺失的目的。本试验以磁珠替代了传统MAPH 技术中应用的尼龙膜，磁珠是一种进行杂交反应的载体，其 上带有被酶切的DNA片段，在其适宜的杂交缓冲液下，与 所要检测的各外显子的探针杂交，当待检者DNA片段与某 段探针完全匹配时，此探针则结合到磁珠上去，若待检者 DNA上dystrophin基因有缺失，则相应缺失部位的探针不能 与磁珠结合，经磁珠缓冲液的清洗，只有结合到磁珠上的探 针才能被回收。传统MAPH方法中，由于尼龙膜面积小 (2mmx3mm)，在多次转移，清洗过程中，尼龙膜上DNA 或探针易受损并且易受污染，影响检测结果。与尼龙膜相比， 磁珠有操作简便，回收探针效率高等优点。 传统的MAPH方法在探针组回收后经多重PCR扩增， 通过电泳技术检测杂交回收的探针，仍存在检测通量的限 制。我们应用寡核苷酸芯片来检测杂交回收的探针，寡核苷 酸芯片的主要原理是通过碱基互补配对原则进行杂交，以检 测对应片段是否存在、存在量的多少，该方法可使检测通量 极大的提高，结果也更直观；应用图像分析软件对芯片进行 定量分析，结果更加精确。 结果：1．建立了磁珠一寡核苷酸微阵列多重可扩增探针杂 交技术。本文以磁珠替代尼龙膜，结合寡核苷酸技术的多重 可扩增探针杂交方法，弥补了因尼龙膜较小，不易操作，易 被污染的缺点，也极大的增加了检测通量，是一种简便，实 用的检测方法。 中文摘要2．运用磁珠一寡核苷酸微阵列多重可扩增探针杂交技术 中文摘要 2．运用磁珠一寡核苷酸微阵列多重可扩增探针杂交技术 共检测了5名症状为DMD的待检者和5名正常对照。结果 5名有DMD症状的待检者在本文所针对的52个外显子中都 检测出有部分外显子缺失。一号样品为外显子45、48、49 缺失，二号样品为外显子49缺失，三号样品为外显子44缺 失，四号样品为外显子45、48、49缺失，五号样品为外显 子48、49缺失。寡核苷酸芯片检测结果与特异位点PCR验 证结果相符，说明结果真实可信。本文5个进行性肌营养不 良患者基因缺失主要集中在外显子44、45、48、49上，符 合文献上关于缺失热区的报道。五名正常对照检测结果为此 52个外显子都无缺失。基因芯片结果经特异性PCR结果证 明为正确的。 结论：磁珠一寡核苷酸微阵列多重可扩增探针杂交技术 应用磁珠代替尼龙膜进行MAPH方法的检测更加简便，应用 基因芯片作为检测工具使结果更加直观，也便于将各荧光信 号应用分析软件进行分析，有效减少了人为判断误差。尼龙 膜与探针杂交后，探针的回收一直是整个MAPH方法的关键 问题，在传统的MAPH方法中探针的回收率很低，我们用磁 珠代替尼龙膜杂交后，其探针回收率较高，使整个试验的成 功率大大提高。目前对进行性肌营养不良大部分外显子缺失 的检测在国内还未见报道。本文应用MAPH检测技术结合磁 珠及寡核苷酸芯片技术检测DMD患者外显子缺失可达52 个，在国内尚数首次。结果证明磁珠一寡核苷酸微阵列多重 可扩增探针杂交方法是一种检测通量高，结果可靠的新型检 测方法，基本上弥补了临床应用于进行性肌营养不良外显子 缺失检测各种方法检测范围小，通量低的缺点。但我们所用 中文摘要的方法也有许多需要改进和完善的方面，例如进一步提高其 中文摘要 的方法也有许多需要改进和完善的方面，例如进一步提高其 平行检N Jb显子的能力，加强质量控制，研发用于除缺失突 变外其他突变类型的检测以及携带者检测等。 关键词：杜氏肌营养不良；分子诊断；多重可扩增探针； 寡核苷酸芯片；磁珠 英文摘要Magnetism 英文摘要 Magnetism bead-oligonucleotide ys based multiplexmultiplex amplifiableli able probe hybridization technology establishment and application inl DMD etection AB STRACT Purpose：Duchenne muscular dystrophy(DMD)is a kind of serious harmed X chromatin—linked recessive inherited disease， in all kinds of hereditary diseases，DMD is one of disease which have the highest incidence rate．DMD patients are m