流式细胞术的原理和应用.PPTVIP

一、免疫学检测的基本原理 抗原与抗体反应的特异性是各种免疫学检测技术的基本原理 二、细胞因子检测方法 细胞因子的临床意义 常规测定法 胞内细胞因子检测方法 细胞因子检测的主要临床应用 （一）细胞因子的临床意义 细胞因子与疾病：正常情况下，细胞因子表达和分泌受机体的严格调控，在病理状态下细胞因子会出现异常性表达，表现为细胞因子及其受体的缺陷，细胞因子表达过高，以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。 细胞因子与治疗：重组细胞因子做为生物应答调节剂。已批准生产：IFN-α、β、γ，Epo，GM-CSF，G-CSF，IL-2，正在进行临床试验的：IL-1、3、4、6、11，M-CSF，SCF，TGF-β等 （二）常规检测方法 分子生物学测定法 生物活性检测法 免疫化学测定法 1.分子生物学测定法 是测定细胞因子mRNA的表达水平，主要有两种方法： 分子杂交技术 多聚酶链反应技术（PCR） 分子杂交技术 制备细胞因子的基因探针； Northern 杂交或细胞原位杂交； 优点：高度敏感和高度特异； 缺点：操作较繁琐 测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。 多聚酶链反应技术（PCR） PCR（polymerase chain reaction)技术，是一种高效的基因体外扩增技术； 将细胞因子产生细胞的RNA提取出来，再经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增； 优点：灵敏度高 操作简便 缺点：测定结果只能代表细胞因子基因的表达，而不能代表活性细胞因子的水平。 PCR原理 PCR是体外酶促合成特异DNA片段的方法。由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： ①模板DNA的变性：dsDNA ssDNA ②退火(复性)：模板DNA与引物的互补配对 ③延伸：DNA模板与引物按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新DNA 链 新链又可成为下次循环的模板,可将待扩目的基因扩增放大几百万倍 RT-PCR反应过程 反转录PCR： mRNA---cDNA---PCR 抽提RNA 反转录合成cDNA PCR 扩增 RT反应体系 模板：总RNA，mRNA 引物：随机引物，Oligo(dT)，基因特异性引物（GSP) 逆转录酶：AMV M-MLV Quant Reverse Transcriptase PCR反应体系 模板：逆转录产物cDNA 目的基因特异性引物； 反应混合液：dNTP，Taq聚合酶，Mg++ RT-PCR反应产物检测 凝胶电泳分析：初步判断产物的特异性。 酶切分析：对扩增产物进行鉴定、对靶基因分型及进行变异性研究。 分子杂交：检测产物特异性，分析碱基突变 核酸序列分析（测序）：是检测PCR产物特异性的最可靠方法 实时荧光定量PCR(Fluorescence Quantified real time PCR) 与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 （1）原理 实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 1) 常用名词概念 扩增曲线 荧光阈值 Ct值 扩增曲线 设定荧光域值 PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号； 荧光域值的设置是3-15个循环的荧光信号的标准差的10倍，即：threshold = 10 ′ SDcycle 3-15 意义：大于荧光背景值和阴性对照荧光最高值，进入指数期的最初阶段； 真正荧光信号：荧光信号大于阈值 荧光阈值（threshold） Ct值 Ct值的含义是：扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的域值时所需要的循环次数 C代表Cycle（循环数） t代表threshold （荧光域值） Ct值的确定 横坐标：PCR循环数 纵坐标：荧光信号强 度 黑线：荧光域值 红线：无模板 ---域值下一 直线 绿线 ：样品 Ct值=17（第17个循环时，荧光信号强度达到域值） Ct值与起始模板的关系 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线 （2）常用标记方法 非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记： TaqMan Probe；