凝胶过滤色谱操作规程.DOCVIP

凝胶过滤色谱操作规程 Gel Filtration Chromatography 仪器型号：Lc-10ADVP 仪器厂商：日本岛津公司SHIMADZU 启用日期：2005.3 仪器组件：泵Lc-10ADvp、示差检测器RID-10A、 控制器SCL-10Avp、柱温箱CTO-10ASvp 可测项目：① 适合水溶性物质（如蛋白质、多肽、多糖、DNA、RNA、水 溶性的有机聚合物和其他水溶性大分子等）的分离和定量分析 ② 水溶性多组份体系的分子量分布测定。 测试步骤：TSK 2500柱子，分子量测试范围3万以下。TSK 4000柱子，分子量测试范围百万以下。 实验准备：换流动相瓶中水，超声10min赶走气泡，检查废液瓶等。 开稳压电源、电脑，打开仪器四组件的电源开关（检测器2500柱子开紫外，4000柱子开示差RID）。 赶气泡（一般更换流动相后需要赶气泡），打开泵的排液阀（逆时针旋转180度），（此步骤非常重要！）按LC-10AD面板上的purge键冲洗泵并赶气泡，等purge自动停止后（观察排液管中无气泡跑出），关闭排液阀（顺时针旋转180度），此过程一般需几分钟。 开启软件CLASS-VP，点击Instrument 1进入控制界面，在LC Setup Assistant-System页面点击组件图块，在跳出的Instrument Setup界面上编辑方法，主要是设置流动相流速、柱温箱温度和运行时间，设置完毕保存方法（一般不需修改，使用原来方法即可）。点击快捷键Instrument on，使用该方法控制仪器。 示差检测器：点击快捷键RID R.flow on，等10min后再次点击RID R.flow off（即按钮弹起），再过10分钟，点击Balance RID（平衡示差检测器），注意整个流路的压力值（泵组件上的示数），与记录本上前一天的压力值对比（如压力值变化大，可能要清洗流路）； 紫外检测器：没有此步骤 等炉温升到40℃，界面“ready”后走基线。用菜单Control-----preview run观察基线，可用快捷键Zeros将基线归零。一次走基线需要25min，如果基线不平（在+1uRIU到-1uRIU内变化可认为平稳），可多次用菜单Control-----preview run走基线，直到平稳。 基线平稳后可进样，标准溶液或样品需要用0.45μm的膜过滤。点击Control-----Single Run，在对话框中设置名称、路径，在状态栏上显示“Waiting for Trigger”时，可准备进样。 取下进样口的保护套、保护针头，用注射器吸取50uL左右的标准溶液或样品，注意不能有气泡，轻轻擦拭针头，水平插入注射孔，然后将手柄逆时针扳至Load位置----------注射（速度要快）----------顺时针扳手柄至Inject位置，进样完成，此时可将注射器拔出，保护套重新盖上。 进样后测试自动开始，观察图形，如果感觉方法中预设置Run time不够，可用Control-----Extend time在run状态下追加时间。 依次将各标准溶液做完后，可用脱机程序Offline Processing处理数据。 关机：全部样品分析完毕，用专用注射器清洗进样口，然后关泵，用仪器侧面的专用冲洗管冲泵（注射器抽取水，从冲洗管一端打入，废液从一端流出），再次开泵，冲洗流路。点击快捷键柱温箱升温炉Oven off。 当Oven温度降至室温，并且冲洗流路时间超过1h后，点击快捷键Instrument off，切断软件与仪器硬件，退出程序，最后关闭仪器各组件电源开关，关闭电脑。 附录A 标准曲线的绘制及定量分析未知样含量 依次分析几个浓度点的标样，保存名称，如STD001.dat，STD002.dat，STD003.dat 打开上列任一谱图，定义需定量的峰：①设置积分参数Method------Integration Events（识别峰的条件）；②点击Analysis------Analyze（标出峰位置）；③定义峰，在图谱上点击右键Graphical programming--------Define peaks，然后在峰前峰后各点一次，对话框显示参数，OK关闭，保存方法；④查看峰定义及设置各标准点浓度，Method------Peaks/Groups，对话框中填上峰名称、标准曲线类型、各点浓度等，关闭，保存方法。 编辑处理序列：①编辑序列Sequence------edit，在对话框相应位置填上几个标样的文件信息。Filename依次填入标样文件名，Method填入前面编辑保存的方法，Level依次填入序号，Run Type第一点选Clear all Calibration，Begin Calibration，最后一个