玉米大斑病菌环腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表达分析.pdf

中国农业科学 2017,50(16):3135-3144 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.16.008 玉米大斑病菌环腺苷酸磷酸二酯酶基因克隆及表达分析 申珅, 李贞杨, 赵玉兰, 李盼, 韩建民, 郝志敏, 董金皋 （河北农业大学生命科学学院/河北省植物生理与分子病理学重点实验室，河北保定 071001 ） 摘要：【目的】获得玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica ）环腺苷酸磷酸二酯酶（cAMP phosphodiesterase, PDE）基因，并分析其在病菌侵染结构发育过程及侵染寄主早期阶段中的表达，为深入探索 cAMP 信号途径调控病 菌致病性的作用机制打下基础。【方法】根据酿酒酵母（ Saccharomyces cerevisiae ）、白色念珠菌（Candida albicans ）、灰霉病菌（Botrytis cinerea ）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae ）、绿僵菌（Metarhizium anisopliae ） 和黑曲霉（Aspergillus niger ）6种真菌PDE基因的保守序列，利用简并引物PCR对基因保守片段进行扩增，结 合RACE和Genome Walking技术获得基因全长及其侧翼序列；利用MEGA 5.0软件对PDE 蛋白预测编码产物进行多 重序列比对，并采用邻近法构建系统发育树；利用 GSDS 分析基因结构，ProtParam 分析理化性质，SOMPA 预测二 级结构，SMART 数据库在线分析保守结构域；收集人造疏水介质诱导下侵染结构发育不同时期以及侵染感病寄主 叶片不同时间的玉米大斑病菌材料，利用 qRT-PCR 技术研究 StPDE 在病菌侵染结构形成过程中不同阶段的转录水 平。【结果】玉米大斑病菌基因组中存在 1 个高亲和力磷酸二酯酶基因（ StH-PDE ）和 1 个低亲和力磷酸二酯酶基 因（StL-PDE ）。其中，StH-PDE 全长3 208 bp，包含5个内含子和6个外显子，ORF为2 898 bp。StL-PDE 全长5 054 bp，包含 4 个内含子和 5 个外显子，ORF 为 3 090 bp。StH-PDE 和 StL-PDE 分别含有保守的Ⅰ型和Ⅱ型 cAMP 磷酸二酯酶催化结构域。不同的植物病原真菌中 PDE 同源基因分别呈现出高度的相似性，其中，StH-PDE 与 Magnaporthe grisea、Cordyceps militaris、Metarhizium acridum 等病原真菌的高亲和力磷酸二酯酶基因聚于 同一进化支，StL-PDE 与Ascochyta rabiri、Scedosporium apiospermum、Fusarium oxysporum、Metarhizium album 等病原真菌的低亲和力磷酸二酯酶基因聚于相同进化支。人造疏水介质诱导下，与菌丝相比，StH-PDE 和 StL-PDE 在分生孢子中的表达水平均显著上调，其中 StH-PDE 和 StL-PDE 分别上调了约2倍和52倍。孢子萌发初期两个基 因表达水平显著下调，随着萌发的进行，表达水平缓慢回升，至附着胞形成阶段，基因表达出现了第 2 次高峰， 随后表达水平再次下调。在整个过程中，StH-PDE 的最高表达水平则出现在附着胞形成时期，达到了菌丝体中的 近7倍、分生孢子中的近2 倍，而 StL-PDE 的表达水平始终低于其在分生孢子中的表达水平。StH-PDE 和 StL-PDE 在病菌侵染寄主过程中的表达水平变化趋势与其在人工疏水介质诱导下的表现基本一致。在孢子萌发早期表达显 著下调，随着时间延长，缓慢回升，至接种后18和24 h StH-PDE 表达水平上调，超过萌发初期。【结论】在病菌 侵染结构发育过程中，StH-PDE 和 StL-PDE 均呈现下调-上调-下调的表达水平变化趋势。StH-P