三氧化二砷及p27kip1基因转染对人胃癌生物学行为影响的研究中西医结合临床专业论文.docxVIP

三氧化二砷及P27KIPl基因转染对人胃癌生物学行为影响的研究 三氧化二砷及P27KIPl基因转染对人胃癌 生物学行为影响的研究 博士研究生：宝全 指导教师：胡祥 教授 专业名称：中西医结合临床 摘 要 f ／中西医结合医学，是我国医药科学的特色和优势。为了实现中医 I 现代化和在深层次上进行中西医结合，将中医药学和分子生物学有机 地结合起来，是最有发展前途的研究途径和思路方法之一。二十一世 纪生命科学领域内三大课题是基因组研究、细胞凋亡、细胞信号传导。 中医肿瘤学在肿瘤成因、诊治思路等方面与目前的基因组学相吻合， 具有鲜明的特色和优势，为中西医结合医学研究肿瘤展示了广阔前 景。基因组学治疗肿瘤的策略是：发挥人体中抑癌基因的作用，强化 这类基因的表达，以抑制肿瘤的发生、发展和转移；采用基因置换、 反义RNA技术等方法，抑制癌基因的表达；人为设计细胞凋亡机制， 利用转基因技术或在肿瘤细胞中导入肿瘤抑制基因，诱发肿瘤细胞凋 亡。这些技术路线与中医学“扶正祛邪”的治则完全相符合。 恶性肿瘤细胞的特点是细胞失控性生长，在基因水平上则表现为 抑癌基因的失活、癌基因的激活以及细胞周期调节基因表达的紊乱。 细胞周期调控机制的最新研究进展表明癌基因和抑癌基因作用的归 结点均在对细胞周期的调控，细胞周期紊乱是肿瘤细胞最常见的特征 之一，导致肿瘤细胞不可控性的增长。真孩细胞周期的调控有赖于细 胞周期素依赖性蛋白激酶(eyc]in—dependent kinase，CDK)的顺序 活化，细胞周期素(Cycli 活化，细胞周期素(Cycli ns)和CDK结合形成复合物，促进细胞周 期进行；而细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂(cyclin—dependent ki nase i nhibitOrS，CDIs)对细胞周期有负性调节作用。P27kiPl基 因是CDI的主要成分之一，不仅在细胞增殖、分化等许多基本生理过 程中起重要作用，而且随着多种肿瘤的发生和进展p27kipl蛋白的表 达逐渐降低，是一种抑癌基因。 基因组学防治肿瘤与中医学传统的扶正祛邪治则方法一样，是以改 变、调整相关基因为主要目的。中西医结合防治肿瘤的效果在于通过扶正 祛邪在某种程度上改变了某种基因的表达。氧化砷是 砒霜、复 方青黛)的有效成分，我国学者首次应用砷剂治疗急 胞性白血 病取得显著成功，但其对实体瘤的作用机制并未阐明 先以不同 浓度三氧化二砷体外作用于人胃癌细胞系BGC一823，观察其抑制胃癌细胞 生长及促进凋亡作用，并检测其对p27kipl基因表达的影响，从而阐明三 氧化二砷用于胃癌治疗的机理之一： 第一部分三氧化二砷上调p27ki p1基因表达 促进人胃癌细胞凋亡 目的 研究三氧化二砷(As：O。)对胃癌的诱导凋亡作用及其可能 机制。 ， ／方法用不同浓度的As：0。作用于人胃癌细胞系BGC-823，透射电 镜、l流式细胞仪等方法分别对加药组及对照组胃癌细胞的形态学改 变，细胞凋亡及p27kipl蛋白的表达进行观察和测定。 结果1um01／L(As：0。)处理胃癌细胞48小时呈典型的凋亡特征性 改变：在形念学上表现为细胞膜完整、染色质固缩、核碎裂；流式细 胞仪显示，在G1期前出现亚二倍体凋亡峰，实验组p27kipl蛋白高 表达。结论 表达。 结论 三氧化二砷可通过上调p27kiPl基因高表达诱导人胃癌细 胞凋亡。 二十一世纪是生物科学和生物工程的时代，基因工程是生物工程 的主要内容之一，而基因克隆技术是基因工程的核心技术，这项技术 的主要目的是获得某一基因或DNA片断的大量拷贝，以便深入分析该 基因的结构和功能。为探讨三氧化二砷作用于胃癌细胞上调p27kipl 基因表达后，胃癌细胞凋亡的机制，本试验进一步采用DNA重组技术， 在体外克隆p27kipl基因，为进一步研究p27kipl的生物学功能提供 试验基础 第二部分 人p27ki p1基因的克隆及其序列测定 目的 构建人p27kipl基因原核表达载体pMDl8～T Vector～ p27kiDl，克隆人p27kipl基因，为进～步研究P27kipl基因功能提 供试验基础。 ／方法 首先采用异硫氰酸胍一乙酸钠一酚一氯仿一步法提取细 瞍总RNA：RT—PCR扩增p27kiplcDNA；回收与纯化PCR产物后，与克 隆载体pMDl8一T Vector连接，构建重组质粒；PCR和酶切方法筛选和 鉴定阳性克隆，最后以双脱氧末端终止法自动测序仪测序。 结果测序结果显示重组质粒序列与GENEBANK提供的人p27kipl cDNA序列完全一致；表明本实验成功构建人p27kipl基因克隆载体 pMDl8-T Vector--p27kipl。 结论p27kipl基因克隆载体构建成功，可利用其进一步研究 p27kipl基因功能