2019年基因工程技术概述.pptVIP

基因工程技术;Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA ;定义：;基因克隆(gene cloning )： 是指目的基因与载体DNA连接构成的DNA重组体在受体细胞内进行复制、扩增的技术。;应用：;基因工程基本步骤：;基因工程流程示意图;构建重组分子（连接）;目的基因片段来源：;目的基因来源选择：;PCR：;片断的回收与纯化;载体：;克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（PBR322）。 表达载体(expression vector) 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受??细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（pCDNA3）。 ;穿梭载体(shuttIe vector);质粒载体;克隆载体: PBR322 ;;;TA 克隆;TOPO-TA;原核 His-tag: pQE系列(Qiagen), pET22(Novagen) GST-tag: pGEX系列(Pharmacia);pCDNA3系列 (Invitrogen)，;pFLAG-CMV系列(Sigma);Tet-On/Tet-Off Expression Systems ;DNA分子的体外连接：方法 ;两种情况：;碱性磷酸酶处理：;平头末端：;Eco RⅠ; 加同聚物尾： 载体与片段没有共同的粘性末端时，可直接通过末端转移酶分别接上poly（dA）和poly（dT），然后退火，直接转化，分子间空缺部分可以在宿主体内修复。 同尾酶(xho I ;Sal I) ;连接策略：;选择连接位点： ;连接浓度： ;连接反应：;连接酶：两种;其他酶：末端修饰酶;重组子导入受体细胞：;重组子导入受体细胞：途径;转化;感受态菌制备;氯化钙法：原理;重组子的筛选：;插入失活：;α互补现象：蓝白斑筛选; 42℃90s,+900ul LB,37 ℃45min ;阳性克隆的鉴定：;碱裂解法;试剂作用：;初步鉴定;后续：