细胞培养的一般技术促细胞分裂剂激活单核细胞基本原理.pdf

中国试剂网 3.8.8.176 细胞培养的一般技术 促细胞分裂剂激活单核细胞 基本原理 ： 本方法是通过促细胞分裂剂与细胞表面受体相互作用，在体外触发细胞的多 克隆激活。根据所使用的促细胞分裂剂的不同，应答细胞可以是T 淋巴细胞、B 淋巴细胞，或两者同时，或者是单核细胞。 细胞激活可以通过细胞增殖、细胞 因子分泌、表面抗原表达和/或细胞体积的增加进行检测。例如在使用B 细胞激 活剂时，可以通过多克隆免疫球蛋白的分泌进行检测。 表1 常用的促细胞分裂剂和多克隆淋巴细胞激活剂 促细胞分裂剂 所 用 浓 度 应 答 细 胞 刀豆蛋白A ConA 1- 10 μg/ml T 淋巴细胞 植物凝集素PHA 1-5 μg/ml T 淋巴细胞 佛波醇酯PMA 1-10 ng/ml T 淋巴细胞 娄诺霉素+PMA 100-500 ng/ml T 淋巴细胞 脂多糖LPS 2-25 μg/ml 鼠B 细胞 （T 不依赖型）， 单核细胞 美洲商陆PWN 试验测定 人B 细胞 （T 依赖型） 葡萄球菌A ，SAC 1/1000-1/10000 人B 细胞 试剂和设备： · 细胞悬浮液； · 96 孔平底组织培养板； · 含血清培养基 （通常为 RPMI 1640,含10% 胎牛血清，100U/ml 青霉素，100 μg/ml 链霉素）； · 促细胞分裂剂 （见表1），要求纯品或半纯品，有市售商品； · 多通道移液器和微量移液器； · 带570nm 滤片的酶标仪； · 超净工作台； · CO2 孵箱； · 冷冻离心机。 中国试剂网 3.8.8.176 操作步骤： （一）促细胞分裂剂制备 根据说明书将促细胞分裂剂重新溶解于水或培养液中，制成储存液 （如 100×），保存于-20℃。 （二） 促细胞分裂剂滴定 1．在培养液中稀释储存液到所需的第一个浓度，通常为理论最佳浓度的10 倍； 2 ．在培养板或试管中直接将促细胞分裂剂进行浓度递减系列稀释 （100 μ l/孔）； 3 ．每孔平行重复三次； （三） 细胞激活 1．分离外周血单核细胞； 2 ．室温下用培养液300× g 离心10 分钟，收集并洗涤细胞； 3 ． 计数细胞并将细胞在培养液中重新悬浮至106 细胞/ml ，在培养板中每孔 加入100 μl ； 4 ． 在5% CO2 水浴孵箱中37℃孵育 （细胞增殖需2-3 天；细胞因子测定测 定6 小时-2 天；免疫球蛋白分泌测定需5-10 天）； （四）细胞激活定量测定方法 1． 细胞增殖检测方法采用MTT 测定法；