生化科技研究所微生物与细胞专题讨论摘要前言.PDF

生化科技研究所微生物與細胞專題討論 題目: Mistic and TarCF as fusion protein partners for functional expression of the cannabinoid receptor 2 in Escherichia coli 作者: Ananda Chowdhury, Rentian Feng, Qin Tong, Yuxun Zhang, Xiang-Qun Xie 文章來源: Protein Expression and Purification 83 (2012) 128–134 演講者: Kuan-Ting Liu 劉冠廷 R01B22051 指導老師: Chii-Shen Yang, PhD 楊啟伸 博士 演講日期: April 29, 2013 th 演講地點: The 6 Classroom 摘要 G protein coupled receptors (GPCR ：G 蛋白質耦合受體)扮演了生物體中重要的訊 息傳遞以及細胞與細胞之間溝通的橋梁。這些在細胞膜上的受體，接受了身體內 部產生或是外來的特定分子，並對其特定下游路徑進行反應，是人類對藥物反應 的關鍵；而要研究藥物化學分子的設計就必須得到大量且有活性的 GPCR 膜蛋 白質，才能進行後續的結構以及活性分析。這篇研究報告要分享一個可以用大腸 桿菌 C43(DE3)大量表達出大麻素受體第二亞型(cannabinoid receptor subtype 2 ， 簡稱 CB2)的方法，作者利用了另外兩個蛋白質 Mistic 和 TarCF 來做為 Tag 以幫 助膜蛋白質的表現。Mistic 是一穿膜蛋白質，作者將它融合在 CB2 的Ｎ端來提 升產量；TarCF 則是細菌的化學感應傳導蛋白 Tar 的Ｃ端片段，融合在 CB2 的Ｃ 端，並在最外面兩端都加上 histidine tag 方便後續純化。作者比較之後發現：同 時有這兩個蛋白質的幫助，才可以得到最大的 CB2 產量，且有表現出 Mistic-CB2-TarCF 膜蛋白的大腸桿菌在經過 CB2 的 ligands 測試之下擁有結合活 性。此研究分享了一個藉由”表現幫手”純化出 G 蛋白質耦合受體的策略。 Keywords: Mistic, TarCF, Fusion partner, E. coli expression, Cannabinoid receptor 2 前言 ◆本研究之重要性 人體對外來藥物的接收，有一部分是透過細胞膜上的膜蛋白質受體。而針對 GPCR 這類膜受體所設計的藥物佔了目前市面上藥物的一半以上，因此，快速且 大量純化出膜蛋白質的方法是生技公司、藥廠以及研究人員們的夢想。尤其現今 用細胞進行 GPCR 的培養其過程繁瑣且費用昂貴，如果能利用微生物來進行， 如同這篇研究使用的大腸桿菌 C43(DE3)所示，將可以加快作業速度以及降低研 究成本，進一步有助於藥物設計和開發的躍進。 ◆前人做過的研究 由於人類 GPCR (G 蛋白質耦合受體)表現在細菌中，不一定能有穩定且良好的表 現量或活性，因此科學家們就想要利用一個表現量較大或是較為穩定的蛋白質和 GPCR 融合，以這樣融合蛋白質的型式表現在細胞的膜上。這一類的蛋白有可能 是穿膜蛋白或是會出現在膜的兩側，可以幫助目標蛋白穩定、提高表現量、帶領 蛋白質運送到膜上，方便後續的純化分離。因此，這一類的蛋白質稱為 Tag [1] 像是一個火車頭一般。本篇文獻就是想利用 Tag 的方式表現人類 GPCR 在大腸桿 菌上。 ◆研究目的 由於 Cannabinoid Receptor subtype 2 （CB2 ）在活體組織中的表現量非常的低， 因此在結構以及特性的研究受到阻礙，作者希望能用不同大腸桿菌菌株的方式， 以 Escherichia coli 可提供易培養、經濟效益高、速度快、表現量大的特性來純化 出人類的膜蛋白質，方便之後的研究人員使用。 材料與方法 ◆菌種 Escherichia coli C43(DE3)這是一株有膜增生突變的大腸桿菌菌株，可以提高膜 蛋白質的產量，方便純化膜蛋白質的實驗使用。 ◆構築質體 使用 pET-21a 為骨架進行 construct ，作