基于SYBRGreenI的双链DNA定量方法-生物通.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１）：５５～６０ 基于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ的双链ＤＮＡ定量方法 １ １ １ １ １，２ 刘　歆 　徐根明 　郭江峰 　丁先锋 　高晓莲 （１浙江理工大学生物工程研究所　杭州　３１００１８　２休斯敦大学生物学与生物化学系　休斯敦　ＴＸ７７００４－５００１　美国） 摘要　基于ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光染料与双链ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）结合产生荧光的原理，建立一种高精度、 高通量的双链ＤＮＡ定量方法。将梯度稀释后的基因组ＤＮＡ及已知浓度的 ＤＮＡ与等体积的 λ ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（４×）充分混合后，利用荧光定量ＰＣＲ仪采集荧光信号，以ＲＯＸ（１×）作为校正染料 进行定量分析；同时利用紫外分光光度计对样品进行平行测定，比较该方法与紫外分光光度法的 检测限与准确度。紫外分光光度法的检测限为２ｎｇ／ｌ，而ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光定量法的检测限可 μ 达到０．０１５ｎｇ／ｌ，并且在０．０１５～２ｎｇ／ｌ范围内，ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ荧光强度与 ＤＮＡ浓度呈线性关 μ μ λ ２ 系（Ｒ＝０．９９９９），比紫外分光光度法灵敏 １００倍以上，并可准确定量低纯度的ＤＮＡ样品。此方 法具有重复性好、高通量的特点，仅需少量的生物样本即可满足定量要求，为分子生物学研究及 临床检验等多个领域提供了一种可靠的ｄｓＤＮＡ定量方法。 关键词　ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ　定量　双链ＤＮＡ　基因组ＤＮＡ 中图分类号　Ｑ８１９ 　　灵敏、准确的双链 ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）定量方法在生物 ＥＢ是一种常用的凝胶染色荧光染料，由于其自身有较 学研究及应用领域中发挥着重要的作用，尤其对微量 高的本底荧光，与ＲＮＡ及单链ＤＮＡ也有较强的结合能 ［４，５］ ＤＮＡ定量时，如定量肿瘤患者血浆游离循环ＤＮＡ（ｆｒｅｅ 力，因此不适用于特异性双链 ＤＮＡ准确定量研究 。 ［１］ Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８是一选择性与ｄｓＤＮＡ结合的荧光染料， ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇＤＮＡ） ，法医取证 ＤＮＡ及用于亚克隆的 ［６］ 可检测到０．０１ｎｇ／ｌ的ｄｓＤＮＡ样品 ，并受蛋白影响 ＤＮＡ片段等，定量方法的灵敏度及准确度均需达到较 μ ［７］ ［８］ 高的标准。 较小 ；但该染料对ＡＴ富含区有较强的选择性 ，并 ［６］ 　　紫外分光光度法是目前使用较多的ＤＮＡ定量方 且受ＤＮＡ长度的限制（＜２００ｂｐ） 。Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ是一种 ［９］ 法，此方法操作简便，成本低，但存在灵敏度低、测样量