反相高效液相色谱检测鸡血清中的角黄素和虾青素广州智特奇生物.DOCVIP

反相高效液相色谱检测鸡血清中的角黄素和虾青素 广州智特奇生物科技股份有限公司 程栋 陶斌斌 陈冰 摘 要：通过不断优化血清样品处理方法及色谱条件，用反相高效液相色谱建立起鸡血清中的角黄素和虾青素的检测方法，从而进一步评估不同角黄素制剂和虾青素制剂的生物利用率。角黄素和虾青素悬液经口灌胃给予鸡4小时后， 通过翅静脉采血，经处理得血清，然后经过离心、提取、旋蒸后，上液相色谱仪测定。实验结果表明，鸡血清中的角黄素和虾青素含量线性关系良好（R20.99）。结论：本法灵敏度高，易于推广，适用于鸡血清中角黄素及虾青素的检测，对评估角黄素和虾青素制剂的生物利用率有着重要意义。 关键词：角黄素 虾青素 鸡血清 高效液相色谱 角黄素（又叫斑蝥黄，斑蝥黄质，canthaxanthin）及虾青素（astaxanthin）属于类胡萝卜素类色素，具有鲜艳的橙红色，其重要用途之一是作为蛋黄着色剂饲喂产蛋家禽，通过家禽消化道吸收使其最终沉积于蛋黄、皮下脂肪和脚胫等，使其呈现鲜艳的诱人色泽，增加其商业价值。目前评价不同类胡萝卜素色素应用效果的主要方法是罗氏比色法，需要较长的饲养周期，也存在一定的主观性。因此有必要建立一种快速的评估方法，来满足生产实际中大量的制剂样品评估需求。结合类胡萝卜素的消化吸收特点，通过测定鸡灌胃悬液后一定时间内，测定鸡血清中的含量，来评估不同制剂的生物利用率。本试验中通过摸索优化了鸡血清的前处理及色谱条件，在建立起角黄素和虾青素的标准曲线基础上，最终能在鸡血清中起准确的测定角黄素和虾青素含量。 1材料和方法 1.1仪器与试剂 高效液相色谱仪（LC-15C，岛津公司）；旋转蒸发仪（RE-2000A，上海亚荣生化仪器有限公司）；漩涡振荡仪；超声仪；离心机；200ul移液枪 角黄素及虾青素标准品；丙酮（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；正己烷（色谱纯） 1.2标准溶液制备 1.2.1 角黄素标准溶液：称取角黄素标样0.0188g至100ml容量瓶中，N,N-二甲基甲酰胺溶解并定容，移取20ul→250ml、50ul→250ml、50ul→100ml、50ul→50ml、50ul→25ml配置成浓度分别0.01504ug/ml、0.0376ug/ml、0.094ug/ml、0.188ug/ml、0.376ug/ml标准溶液。 1.2.2虾青素标准溶液：称取虾青素标样分别配制成浓度分别0.042ug/ml、0.084ug/ml、0.168ug/ml、0.336ug/ml标准溶液。 1.3样品前处理 采集约5ml鸡血于真空采血管中，4000r/min离心5min，取上层血清200ul至10ml离心管中，加入6ml乙腈和0.6g无水硫酸钠，漩涡混合1min，振荡10min，超声1min，3000r/min离心5min，将上清液移入预置有4ml正己烷的分液漏斗，混合静置分层；收集下层乙腈相。按上述步骤对离心残留物每次用4ml乙腈再重复提取2次，合并3次乙腈相，于40℃以下旋转蒸发浓缩至干。准确移取2ml乙腈，至于旋转蒸发瓶中，超声1min，充分混合内容物后，0.45um滤膜过滤，高效液相色谱进样。 1.4 色谱条件 色谱柱：伊力特C18柱（4.6um×5mm×250mm）；测定角黄素流动相：乙腈；测定虾青素流动相：正己烷+丙酮=86+14；检测波长：470nm；柱温：25℃；流速：1.5ml/min。 2 结果与分析 2.1 角黄素标准曲线的建立 2.1.1 下图1为角黄素的标准色谱图，其出峰时间在8.6-10分钟 下图2为鸡血清样品的色谱图，出峰时间的8.6-10分钟峰即为血清中的角黄素。通过出 峰时间、峰型与标准品的比较，及多次验证试验，确认血清角黄素的峰型为下图所示。 0.01.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min -0.05 0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 0.55 mV 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5 13.0 13.5 14.0 14.5 MPa ?ì2a?÷ A:470nm 1 图2 鸡血清样品色谱图（角黄素） 2.1.2 角黄素标准溶液与峰面积 经高效液相色谱测定，角黄素标准溶液浓度及峰面积如下表1 表1角黄素标准溶液与峰面积的对应关系 浓度（ug/ml） 0.01504 0.0376 0.094 0.188 0.376 峰面积 1757 4438 11213 22488 45025 从下图3可知，血清中角黄素浓度（ug/ml）的标准曲线为 y=0.0000083402x+0.0004750797，R2=0.9999，