密度梯度离心.PPT

* * 如缓冲液里面加有Ca2+，钙离子能够促进质膜碎片的聚集 * 需要提醒学生正确使用移液枪 * 1. 在用于 Bockman SW28 号转头（或与其等同的产品）的 Uitradear 离心管中，小心地在 15 ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加一层 15 ml 1.0 mol/L 的蔗糖溶液，形成 30 ml 的梯度：1.0 mol/L 蔗糖和 1.5 mol/L 蔗糖溶液中含：10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5)1 mmol/L EDTA，pH 7.52. 小心加入线粒体悬液（总体积 7 ml），60000 g（22000 r/min）离心 20 分钟。线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 界面处形成一薄层。3. 移去样品层及其与 1.0 mol/L 层的交界。4. 用一巴斯德吸管轻柔的在 1.5 mol/L 层顶部吸出线粒体。5. 稀释蔗糖溶液，17000 g 离心 15 分钟沉淀线粒体。6. 用 30 ml 缓冲液洗一次，重悬浮于合适体积的适于后续工作的缓冲液中。 * * Copyright ? 2013 by W. H. Freeman and Company Molecular Cell Biology, 7th Edition Lodish et al. Copyright ? 2013 by W. H. Freeman and Company Molecular Cell Biology, 7th Edition Lodish et al. Copyright ? 2013 by W. H. Freeman and Company Molecular Cell Biology, 7th Edition Lodish et al. Copyright ? 2013 by W. H. Freeman and Company Molecular Cell Biology, 7th Edition Lodish et al. Copyright ? 2013 by W. H. Freeman and Company Molecular Cell Biology, 7th Edition Lodish et al. Copyright ? 2013 by W. H. Freeman and Company Molecular Cell Biology, 7th Edition Lodish et al. Copyright ? 2013 by W. H. Freeman and Company Molecular Cell Biology, 7th Edition Lodish et al. Copyright ? 2013 by W. H. Freeman and Company Molecular Cell Biology, 7th Edition Lodish et al. 一、实验目的： 1. 初步了解细胞内各种成分的分离方法； 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法； 3、对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。 实验十二、细胞核与线粒体的分级分离 (差速离心法与密度梯度离心) 细胞器分离基本步骤 二、实验原理 细胞破碎 分离、纯化 细胞器鉴定 （一）细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法 2.高速组织捣碎机法 3.超声波处理法 4.化学裂解法 5.反复冻融法 细胞破碎的注意事项： 1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液（0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小，在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。 2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长，导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。 （二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。 二、实验原理 根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别，分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。 差速离心法 (Differential centrifugation) 9.4 Isolation and Characte