铜绿假单胞菌SOS反应阻遏蛋白LexA的复性及活性研究-OALib.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（９）：１９～２３ 铜绿假单胞菌ＳＯＳ反应阻遏蛋白 ＬｅｘＡ的复性及活性研究  陈　炫 　汤绍辉　查庆兵　唐　晖　刘　芳 （暨南大学附属第一医院临床实验中心　广州５１０６３２） 摘要　目的：对ＬｅｘＡ蛋白复性方法进行优化，对复性后的ＬｅｘＡ蛋白的生物学活性进行分析。方 法：采用含有ＧＳＨ／ＧＳＳＧ的缓冲液，一步稀释法对变性ＬｅｘＡ蛋白进行复性，用镍离子亲合柱及阳 离子柱层析法对复性后的ＬｅｘＡ蛋白进行纯化，再以ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５凝胶柱脱盐，采用非变性聚丙 ? 烯酰胺凝胶电泳和 ＲＰＨＰＬＣ法检测复性效果，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析复性前后及经ＤＴＴ处理后的 ? ＬｅｘＡ蛋白的免疫反应性，凝胶滞留电泳试验检测复性ＬｅｘＡ蛋白与 ＤＮＡ的特异性结合能力。结 果：复性后的ＬｅｘＡ蛋白出现单体和多聚体的形式，多聚体是由单条肽链聚合而成。ＬｅｘＡ单体和 多聚体与兔抗ＬｅｘＡ多克隆抗体均有较好的反应性。复性后的ＬｅｘＡ蛋白能与ＳＯＳ盒序列发生特 异性结合。 关键词　铜绿假单胞菌　ＬｅｘＡ　复性 中图分类号　Ｑ５１ 　　ＳＯＳ反应（ＳＯＳｒｅｓｐｏｎｓｅ）是细菌ＤＮＡ分子受到较 病机理的研究均有重要意义。在本研究中，对ＬｅｘＡ蛋 ［１］ 大范围损伤或复制受到抑制时出现的修复机制 。 白复性方法进行了优化，并对复性后的ＬｅｘＡ蛋白的生 ＬｅｘＡ是细菌ＳＯＳ反应的阻遏蛋白，它结合在操纵子的 物学活性进行了分析。 调控序列上抑制一系列包括与ＤＮＡ的切除、重组及复 １　材料与方法 制有关的酶的表达。当细菌发生 ＳＯＳ反应时，阻遏蛋 白ＬｅｘＡ发生自我切割，其抑制作用被解除，由此产生 １．１　材　料 细菌进化、毒力因子和耐药基因水平传播加速等后 　　铜绿假单胞菌ＰＡＯ１株由本室保存。纯化的ＬｅｘＡ ［２～６］ 果 。 ［７］ 蛋白及兔抗ＬｅｘＡ多克隆抗体由本室制备 。尿素、三 　　铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ，ＰＡ）是医 氯乙酸、咪唑、ＢＳＡ、谷胱甘肽氧化型（ＧＳＳＧ）、谷胱甘肽 院内感染主要的致病菌之一，严重危害人类健康和生 还原型（ＧＳＨ）、丙烯酰胺、Ｎ，Ｎ 亚甲基双丙烯酰胺、 ? 命。近年来，随着广谱抗生素、激素及免疫抑制剂的广 ＴＥＭＥＤ、ＤＴＴ、ＰＭＳＦ、ＨＥＰＥＳ、鲑精ＤＮＡ等为Ｓｉｇｍａ公 泛使用，以及各种侵袭性诊断和治疗手段的不断增加， 司产品。蛋白Ｍａｒｋｅｒ购自北京鼎国生物技术公司。 ＰＡ在医院感染中占有越来越重要的地位。ＰＡ具有极 ＨＲＰ标记羊抗兔ＩｇＧ购自武汉博士德公司。Ｔ４多核苷 强的环境适应力和抗生素耐药性，常表现对多种抗生 酸激酶为Ｐｒｏｍｅｇａ公司产品，［ ３２Ｐ］ＡＴＰ购自北京亚 γ? 素多重高度耐药，临床治疗十分棘