褚泰伟《应用化学基础》第八章标记化合物.pptVIP

2. 自由基清除剂对标记物贮存的影响（2℃） （水溶液） * 次级分解是标记化合物辐射自分解的重要因素。若在标记化合物体系中，加入能与自由基发生快速反应的物质，阻止及清除自由基与标记物作用，则可以有效降低标记化合物的次级分解。 选用清除剂时，应注意到它本身或它的辐解产物（乙醇辐射分解产生乙醛）不能与标记化合物发生化学或生物化学反应。 * 3. 降低贮存温度 降低温度，使分解产生的自由基与标记化合物作用的速度减慢，亦能使标记化合物的分解减少。 但是，对于标记化合物的溶液来说，当温度下降而发生缓慢冻结时，标记分子被聚集在一起，反而加速自辐射分解。 * 一般储存温度: 不引起溶液冰冻的可行的最低温度 水溶液: 0 ~ 4℃ / 液氮下快速冷冻 乙醇 / 有机溶剂: 冰点以上 * 标记化合物低温储存： 14C，32P，35S，卤素一般在-40℃。 苯作溶剂的标记化合物则以不使其冻结的温度为宜，一般以高于其熔点5--10℃保存。 3H标记化合物需用液氮快速冷冻保存。只有在-140℃下快速冷冻，标记分子才能保持均匀分散在溶剂中。 * 4、选择适当的溶剂： 耐辐射、溶解能力好、高度纯化。 5、纯化： 标记化合物长期储存时应定期纯化。 * * 这张图表列举了一些重要的碘的放射性同位素，其中常用的123、125、131 * 原理：通过氧化剂使碘化物氧化成碘分子，然后与化合物分子中的碘交换获得放射性碘标记化合物 * 碘标记最关键的因素是氧化剂，根据氧化剂的不同进行分类 * 适合没有络氨酸、色氨酸、组氨酸的蛋白质 * 每种发射β射线的核素都有自己的特征β能谱 * 每种发射γ射线的核素都有自己的特征γ能谱 * 14C的自旋量子数 = 0，所以无核磁共振谱。原子的自旋量子数（I）≠ 0 2、乳过氧化酶法： 少量过氧化氢存在时，乳过氧化酶能促使过氧化氢将碘离子I-转化为活性形式I+,而使蛋白质碘化。 优点：对蛋白质的损伤小。 缺点：标记率比较低。 * 乳过氧化物酶法： 乳过氧化物酶 + H2O2 O2（新生氧） 标记原理： Na125I 125I2 * ⑴反应液： Na125I 37MBq （10μL） 缓 冲液（pH5.6） 30μL 蛋白质 5μg（10μL） 乳过氧化物酶 25ng（10μL） H2O2 200ng （10μL） 室温 7min ⑷ 巯基乙醇（10mmol/L）0.5mL(中止反应) ⑵ H2O2 200ng （10μL） 室温7min ⑶ H2O2 200ng （10μL） 室温7min ⑸ 加入NaI载体溶液, 用SephadexG50柱层析分离纯 化 125I-蛋白质 * 注意事项： 1. 乳过氧化物酶使用前新鲜配制 2. H2O2保持低浓度： 0.1mmol/L 3. 酶的浓度↑，标记率↑ 酶的用量 1% 标记蛋白 ↓酶自身碘化而引入的放化杂质 * 3.双酶标记法； 葡萄糖氧化酶＋葡萄糖 H2O2 标记原理： 乳过氧化物酶 O2（新生氧） Na125I 125I2 * ⑴反应液： Na125I 37MBq （10μL） 缓 冲液（pH7.0） 30μL 蛋白质 5μg（10μL） 乳过氧化物酶 25ng（10μL） 葡萄糖氧化酶 10ng （10μL） 室温 4~20min 葡萄糖(0.5%) 5μL (2) 0.1% 叠氮钠 100μL 中止反应 (3) 用Sephadex柱层析分离纯化 * 4、间接法 避免了氧化剂和蛋白质的直接接触，对蛋白质的活性影响较小。 载体主要是联结到蛋白质分子表面的赖氨酸或蛋白质的N-末端，可以用来标记缺乏酪氨酸残基的蛋白质。 引入的载体要引起蛋白质分子的位阻效应，故不用于分子量1万的蛋白质的标记。 碘的利用率和标记率均低于直接法。 * 间接标记法(Bolton－Hunter法): CH2CH2C－O －N HO O O O 125I 125I CH2CH2C－O －N OH O O O + NH