分子生物学（杨洋）第三章-dna的复制-thereplicationofdna.pptVIP

1.2 DNA is synthesized by extending the 3’ end of the primer (DNA通过引物3’端的延伸进行合成） 1.3 Hydrolysis of pyrophosphate (PPi) is the driving force for DNA synthesis（焦磷酸水解是DNA合成的驱动力） 当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时，校正外切核酸酶可将此核苷酸从引物链的3‘端去除 给了DNA聚合酶第二次添加正确核苷酸的机会 校正外切核酸酶—键盘上的“delete”（删除）键 只能将最近发生的错误去除掉 校正外切核酸酶极大地增加了DNA合成的精确度，从每添加105个核苷酸插入1个错误碱基降低到每添加107个核苷酸插入1个错误碱基 但是仍然高于细胞中观察到的实际突变概率：每添加1010个核苷酸出现1次错误） 下一章：复制后的错误修复 DNA的合成只能从5‘—3’进行（沿着3‘端进行合成） 半不连续复制：两条暴露的模板中只有一条能够随着复制叉的运动进行连续复制，在此条模板链上，DNA聚合酶简单地尾随复制叉，此模板指导下新合成的DNA链称为前导链（ Leading strand） 另一条模板链指导DNA聚合酶在与复制叉移动相反的方向上运动，此模板指导下新合成的DNA链称为后随链（ Lagging strand），此条DNA链必须以不连续方式进行合成 在后随链上形成的新链DNA短片段称为冈崎片段（Okazaki fragment）：细菌中1000-2000个核苷酸，真核生物中100-400个核苷酸 冈崎片段被合成出来之后，相互之间很快共价连接成一条连续的完整的新DNA链，因此冈崎片段是DNA复制中短暂的中间产物 半不连续复制模型的提出和证明：冈崎片段（Okazaki fragment）的发现 Okazaki选择T4噬菌体的DNA复制作为模型来研究 在逐渐缩短脉冲标记时间的情况下，用3H-脱氧胸苷来脉冲标记进行T4噬菌体DNA复制的大肠杆菌 2秒钟脉冲标记时间，通过超速离心测定新合成片段的大学 前导链和后随链都需要引物酶来起始DNA的合成。但是引物酶在这两条链上的工作频率却相差极大-why? 每条前导链只需要一条RNA引物，相反后随链的不连续合成意味着每个冈崎片段都需要新引物 所以后随链的合成需要数百至数千的冈崎片段及其相关RNA引物 引物酶不需要特异DNA序列来起始新RNA引物的合成，相反引物酶只有在与其它DNA复制蛋白如DNA解旋酶结合时才被激活 引物酶一旦被激活，即用最新暴露的后随链模板合成RNA引物，而这种合成是没有序列特异性的 为了用DNA取代RNA引物， RNA酶H识别并除去各条RNA引物的大部分 RNA酶H特异性地降解与DNA碱基配对的RNA（H：RNA-DNA杂交链中的杂交） 除了与DNA末端直接相连的RNA引物外， RNA酶H可除去其它所有的RNA引物 RNA酶H只能断裂2个核糖核苷酸之间的键 DNA连接酶（DNA ligase)：在毗邻的5’-磷酸基团和3‘-羟基之间形成一个磷酸二酯键，填充切口 DNA解旋酶的延伸性(Processivity)：每次和底物集合后可解开DNA上的多个碱基对，具有高度的延伸能力，解旋酶只有到达其环绕的DNA末端时才被解离下来 DNA解旋酶的极性（polarity): 解旋酶在单链DNA上都沿着一定的方向运动，5‘-3’，3‘-5’。此方向始终是根据其结合的DNA链而不是去除的那一条链决定的 解旋酶沿单链DNA的运动也需要化学能量的提供—ATP水解提供能量 新产生的单链DNA必须保持碱基未配对状态，直至可被用作DNA合成的模板为止 为了使分开的链稳定，单链DNA结合蛋白（SSB）迅速地结合其上 一个SSB的结合会促进另一个SSB与其紧邻的单链DNA结合---协同结合（ Cooperative binding），SSB分子相互之间也能够结合，大大稳定了SSB与单链DNA之间的相互作用 协同结合使单链DNA随着DNA解旋酶的释放而很快被SSB所覆盖，一旦覆盖，单链DNA即处于伸直状态，抑制分子间的碱基配对 SSB以序列非特异性方式与单链DNA相互作用：静电相互作用，无氢键作用 DNA聚合酶本身只能使与单链DNA模板退火的引物有效的延长。而引物酶，DNA解旋酶以及拓扑异构酶（复制叉上工作的酶）等极大地扩大了DNA聚合酶可能的底物范围 引物酶提供了在任何单链DNA上都能起始新的DNA链的能力 DNA解旋酶对双链的解离和拓扑异构酶对正超螺旋的消除使DNA聚合酶能够复制双链DNA 虽然不同生物中这些蛋白质名称不同，但是细菌，酵母，人等生物均使用这一套酶的活性来完成DNA的复制—保守性 如