叶绿体色素纸层析分离试验的关键步骤.DOCVIP

叶绿体色素纸层析分离实验的关键步骤 赵子峰，张亚丽，吕辉，郑蔚虹(黑龙江省齐齐哈尔大学生命科学学院生物学系，161006) 生物学教学，2003年(第28卷)第6期 摘要：通过对比85%丙酮、95%乙醇及乙醚三种有机溶剂在提取叶绿体色素的纸层析分离实验中发现，采用乙醚和丙酮混合液提取叶绿体色素的方法，能取得了良好的实验效果。 1前言 影响叶绿体色素层析实验效果主要有以下几个因素： ①取材，材料中叶绿体色素的含量高低和取材的量；②提取溶剂的选择，一个合适的提取剂，不仅要考虑提取效果，而且还要经济节约、操作容易以及污染程度小；③滤纸，选择一种适于观察而且又操作容易的滤纸处理方法；④层析剂，寻找一种有利于色素迅速扩散的层析剂。 在前人做过的大量实验中，有人从取材入手，通过几种材料对比而选出一种较好的材料；有人从滤纸出发，将滤纸条改成灯芯状或用圆形滤纸代替；还有人将层析溶剂加以改进，但实验效果仍不是很理想，原因是胡萝卜素及叶黄素含量低、色带浅。我们认为提取溶剂的选择是最关键的步骤，即如何提高提取液中各色素含量是本实验的关键。一般情况下，各种植物叶片中的叶绿体色素总含量略有不同，但各种成分所占比例几乎是差不多的，叶绿素与类胡萝卜素的分子比例约为3：1，倘若改变提取溶液成分使黄色素含量提高，层析的效果将大大提高。 2材料方法 2.1材料 选择颜色为深绿色的完整健康的菠菜叶片若干，在烘箱内(48℃)烘干约半小时，待叶片水分失去一半左右为宜。亦可在阴暗处阴干。然后，去掉粗大叶脉，称取2ｇ。 2.2方法 实验设计分为六组。 (1)不加提取溶剂直接研磨，待研磨充分后加入丙酮，乙醚，乙醇中任何一种溶剂10ｍＬ，过滤。所得墨绿色溶液即为叶绿体色素提取液。 (2)不加提取溶剂直接研磨，待研磨充分后加入丙酮，乙醇，乙醚任意两种混合后的混合提取溶剂10ｍＬ，过滤。所得墨绿色溶液即为叶绿体色素提取液。 (3)直接研磨后，加5ｍＬ丙酮(或乙醇)，然后过滤。将过滤后的残渣溶于5ｍＬ乙醚中。再次过滤，最后将两次所得的滤液混合，所得的墨绿色溶液即为提取液。 (4)取两份材料，直接研磨后分别加丙酮(乙醇)5ｍＬ，乙醚5ｍＬ，然后过滤，最后将两种滤液混合，即得墨绿色提取液。 (5)加入5ｍＬ水迅速研磨，然后用多层纱布过滤，向滤液中加10ｍＬ乙醚萃取，分层。取上层深黄绿色溶液即为所得的提取液。 (6)丙酮单独作提取剂的滤液中加少量乙醚。 3结果 叶绿体色素纸层析分离实验结果如下表。附表　叶绿体色素纸层析分离实验结果比较（见后） 第一组实验中各叶绿体色素含量不等，丙酮提取液中绿色素多，乙醚提取液中黄色素相对多些。 第二组实验中，当乙醚：丙酮2：1混合作提取时，各叶绿体色素比例相当，含量较高，层析后的效果好，各色素带清晰，分界明显。用乙醇代替丙酮，含量较高。但各色素带不清晰。 第三组的效果同第二组，但步骤繁琐，不宜采用。 第四组的效果也同第二组，但步骤繁琐，材料需要多。 第五组层析后的效果较好，各色素带清晰，分界明显，但绿色素含量相对低。 第六组层析的效果不是很好。在方法二中曾做过比例为1：1、1：2、2：1、3：1、1：3五组同体积的对比实验。从中得出当丙酮：乙醚为1：2时，提取的效率最高。 4讨论 本实验成功之处在于获得了高浓度的叶绿体色素。从叶绿体色素的种类和含量来分析，选择不同的植物对实验效果影响较小。但从研磨难易程度上考虑，则应选择一些象菠菜、藜等一些藜科植物的肉质化叶片，而其中菠菜分布广泛，生长受季节影响较小，取材方便，故而取材为菠菜较好。新鲜叶片含水量相当高，约70%。这样，一方面在同质量条件下降低了叶绿体色素实际含量；另一方面还可能稀释提取溶剂，降低提取效率。研磨时也不易研磨，因而需将材料进行初步处理。另外，叶片被烘干后不易研磨，而当叶片失水约一半时进行实验，操作和效果都十分令人满意。 有人在研磨过程中加5ｍＬ丙酮目的是为了提取出先研磨出来的叶绿体色素，但在实际操作过程中，这5ｍＬ丙酮大部分发挥发掉了，药品损失，污染空气。方法一、二、三、四均只有在过滤时会污染空气，而其他操作则可在无污染的前提下进行。几种实用性强的提取方法中的丙酮亦可用乙醇代替，减少对操作人员的毒害。但层析效果中的绿色素部分颜色略淡。方法五中各操作步骤几乎不对空气产生污染。如果在通气不良的环境中进行实验，最好采用此方法。此方法在研磨时所含颗粒较大，叶绿体色素很少溶于水中，因滤纸过滤速度慢，而采用多层纱布过滤可提高过滤速度。由于水会溶解一部分细胞色素，而乙醚又不会在此条件下将它们萃取出来，从而起到了对提取液纯化的作用，使层析效果更加明显。 乙醚有利于黄色素的提取。为了提高黄色素含量，而采用乙醚。但单一用乙醚，叶绿素含量不高。如果采用乙醚：丙酮为2：1的混合液提取，则能取得令人满意的效果。