电泳-生命科学学院.PPTVIP

电泳 生命科学学院 张丽萍教授 电泳:带电粒子在电场中的定向移动 原理 :有效长度 :实际电压 原理 V:泳动速度cm/秒or分(秒-1,分-1) d:泳动距离cm/电泳时间t(秒,分) E:电场强度 伏特/cm u:泳动率or泳动度(cm/伏· 秒or分) U:电压/支持场的长度 (有效长度) U:常压(100—500v) 高压(500—10000v) 仅需几分钟 影响u的因素 某一带电粒子的u只取决于带电质点的性质(内因) 1 净电荷 2 质点大小 3 质点形状 影响u的外因 1 V ( U/L) 2 缓冲液的PH (PH恒定) 3 I离子强度[ I ]= 最适:0.02—0.2 4 电渗:液体对固体支持物的相对移动 聚丙烯酰胺凝胶电泳 支持物:单体丙稀酰胺(Acr) 交联剂:甲叉(or亚甲)双丙稀酰胺[Bis] 聚合 1光聚合:核黄素为催化剂(阳光,日光) 制大孔胶 2化学聚合: 过硫酸铵(NH4)2S2O3 APS (引发剂) N,N,N’,N’,--四甲基乙二胺 TEMED (加速剂) 制小孔胶 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶网孔大小: 聚合链长度:由Acr浓度 交联程度:由Acr与Bis相对比例 Bis的浓度低,孔径大,可在聚合前调节单体与Bis的浓度比 如: Acr Bis T(%) 小孔 28.0g 0.735g 7% 大孔 10.0g 2.5g 2.5% 聚丙烯酰胺凝胶电泳(圆盘式)PAG ——分离血清Pr (一)不连续性 1 凝胶孔径大小不同 单体浓度 交联度 大孔胶:T=3% C=20% 小孔胶:T=7% C=2.5% 2 缓冲液离子成份的不连续性 大孔胶 PH=6.7 先行离子 存在于凝胶层中任何PH值下 随后离子 存在于电极缓冲液中 PI=6.0 pKα1=2.34 pKα2=9.70 在 PH=6.7时,只有小部分解离为 配对离子Tris Pr分子在PH6.7时以Pr-形式存在 m:迁移率 α:解离度 3 PH的不连续性 PH 大孔(浓缩)胶 6.7 小孔(分离)胶 8.9 缓冲液 8.3 (二)不连续性可控制Gly的解离度,从而控制有效迁移率 1.在大孔胶中,要求Gly的有效迁移率低于所有Pr,经计算PH=6.7 2.在小孔胶中,要求Gly超过所有Pr.Pr留在后面进行普通的电泳与分子筛分离分成多个区带.(此PH实测为9.5) 在 前 (三)三种物理效率使样品分离效果好,分辨率高。 1一般电泳分离的电荷效应. 带电多,MW小, 迁移快 2不连续系统对样品的浓缩效应 迁移率: 被压成薄层 3. 凝胶对样品分子的筛选效应 等电聚焦(Isoelectro focusing IEF or EF) 原理: Pr为两性电解质,不同Pr其aa的数量,种类及占比例不同,因此PI不同,PI范围窄且净电荷为零,因此依PI分离Pr. EF是在凝胶中加两性载体电解质,通直流电后,可形成从阳极到阴极逐步增加的PH梯度(连续的,稳定的,线性的PH) 原理 当Pr在电场中迁移到它的PI时,由于净电荷为零,不再移动. 如扩散,附近的凝胶会使其荷电,阳,阴极会重新吸引它回到PI位置.因此Pr只能在PI位置被浓缩成窄,稳定的带.称这种浓缩效应为聚焦. 只要凝胶中的PH梯度范围足够窄,便可将PI相近的Pr分开,EF是电泳技术中分辨率最高的技术. 等电聚焦方法(是EF的关键) 1载体两性电解质CA 分辨率0.01PH 2 固相PH梯度(1975年)IPG 以具弱酸或弱碱性质的丙稀酰胺衍生物 CH2═CH─CO─