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微流控芯片光学检测技术在细胞研究中的应用与研究进展 微流控分析芯片是通过微加工技术将微管道、微泵、微阀、微储液器、 微电极、微检测元件、窗口和连接器等功能元器件，像集成电路一样 集成在芯片材料上的微全分析系统。微流控分析技术已经成为重要的 化学及生物分析手段，其分析的优越性（材料及试剂的低耗、原位分 析、快速实时等）在细胞、分子水平检测得以应用和展现，尤其在细 胞研究及应用方面，由于微流道尺度与细胞良好的相容性，可以在休 外实现对体内细胞环境的高度模拟，所以在命科学中的细胞培养、 细胞操纵、试样处理及细胞检测方面有诸多应用，成为细胞及单个细 胞实时检测和研究的新平台。许多微流控芯片研究致力于设计创造多 功能微系统整合细胞检测中的分析步骤，从而在微系统上实现细胞特 别是单细胞生理、病理及药理等方面的研究。微流控芯片自身的设计 和制作技术、芯片上细胞研究模型和方法的建立离不开检测方法和技 术的探索与应用。 目前，微流控芯片上细胞研究中的检测技术主要采用光学检测和电化 学检测。光学检测灵敏度高、设备简单且易于与微流控芯片相结合， 更有潜力应用于活细胞实时检测。微流控芯片上光学检测方法依原理 可分为荧光检测、化学发光和生物发光检测、拉曼光谱检测、折射率 检测、热透镜光谱检测和表面等离了激元共振检测等。本文对近年来 微流控芯片上细胞研究中的光学检测方法与技术进行综述。 1 荧光(Fluorescence)检测 荧光化合物在一定的激发波长下可以释放特定的荧光，而其它物质对 特定荧光物质的信号交叉干扰很小，故而利用荧光光谱可以灵敏地检 测荧光物质。荧光检测灵敏度高且易与微流控芯片相结合，从而使其 成为微流控技术中最主要的光学检测方法之一。 荧光检测初时主要通过对细胞成像显示检测芯片上细胞的长和活 动状况，后来逐渐应用到细胞膜和细胞组分的研究中。Yager研究组 在微流控芯片上对大肠杆菌进行溶膜、提取细胞中B■半乳糖昔酶，并 用荧光标记底物试卤灵■半乳毗喃糖昔(RBG)检测B■半乳糖昔酶含量， 最大可以提取到165nmol/L的价gal,应用不同的流速设置还可以用于 分析其它细胞组分。Farinas等在微流控芯片上用荧光检测分析人T 淋巴细胞的离子通道活动情况，用毛细管从微培养板中吸取测试样本 与THP-1细胞混合并进一步与微流道中的电势敏感荧光染料混合，利 用膜去极化和超极化时阴离子染料DIBAC4和阳离子染料Syto62的荧 光比率变化测量单细胞膜电势，相对于膜片钳技术而言，是一种简单 的细胞离子通道活力检测的方法。 激光诱导荧光(LIF)可以精确控制激发光的参数，其敏感性更高，检出 限一般在10A-13?10八一9mol/L之间，因而用LIF进行微流控上细胞 及其裂解物的检测非常普遍。微流控芯片上LIF检测有非共聚焦和共 聚焦检测系统两种。激光共聚焦技术可以有效减小样品照射体积，从 而减小散射光对灵敏度的影响，因而共聚焦检测系统的信噪比(SNR) 较非共聚焦系统高。李永新等用LIF检测微流控芯片上电泳分离的四 种病原微生物DNA,可检测出lxlOA2cfu/mL的病原菌。Hellmich等 用共聚焦LIF■微流控芯片系统(见图1)检测单细胞的裂解组分。系统在 可见光区可检测1x10八一 13mol/L的荧光素;在紫外区内利用Trp、Tyr 和Phe3种氨基酸的LIF特性完成对蛋白质的分离和无荧光标记检测。 他们后续通过减小入射激光的功率和校正共聚焦的针孔将蛋口质和 氨基酸的检岀限降低了 2个数量级;再通过在PDMS中整合炭黑颗粒 和涂覆基于聚氧乙烯的三嵌段共聚物F108层芯片表面修饰进一步提 高了微流道中蛋白质的分离效率和LIF检测的敏感度，对氨基酸的检 出限达到2?5xlOA-8mol/L,并在芯片上实现对单细胞中低浓度蛋白 质的无标记检测。 许多研究者在微流控荧光检测系统的小型化方面做了有益尝试，将光 源和其它微设备组件整合，发展出各种小型化系统用于细胞及生物分 子分析。Joo等将一个发光二极管(LED)、一个固态光电倍增管(SSPM)^ 聚电解质凝胶电极(PEGS)与玻璃微流控芯片组装在体积 15cmxl0cmxl0cm的微系统中，这个便携式的微流控细胞计数器可以 简单而快速地用电阻抗和荧光两种检测方式区分细胞和微粒子。Kuhn 等设计出小型化的完全芯片整合的电光学陷阱，其激发能水平比常规 光学陷阱低5个数量级，并运用荧光检测完成大肠杆菌DNA的光漂 白动力学研究。 微流控荧光检测灵敏性高，影响其自身灵敏度的因素主要来自瑞利和 拉曼散射，同时芯片本身背景荧光的去除是提高检测精确度的重要因 素，此外检测的小型化将更便于对细胞生理生化反应的检测。特异的 荧光探针如量子点及免疫方法的结合，微流控表面图案的设计可以省 去对分析物的纯化步