表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析.pdfVIP

中国试剂网 3.9.101 表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析 一、原理 细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS 与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的 SDS 结合蛋白质，使其带 相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE ）上，不同蛋白质的迁移率 仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根 据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。 二、试剂准备 1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺 （Acr ）29.0g ，亚甲双丙烯酰胺 （Bis ）1.0g，混 匀后加ddH2O，37OC 溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。 2 、1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g 加ddH2O 溶解, 浓盐酸调pH 至8.0,定容 至100ml。 3、1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g 加ddH2O 溶解, 浓盐酸调pH 至6.8,定容至 100ml。 4 、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g 加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至 100ml。 5、10×电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g ，10% SDS 10ml 加ddH2O 溶解, 定容至100ml。 6、10%过硫酸铵 （AP ）： 1gAP 加ddH2O 至10ml。 7、2×SDS 电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，β-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml ，0.1%溴酚兰 1.0ml ，ddH2O 3.5ml 。 8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰 0.25 g ，甲醇225ml ，冰醋酸 46ml ，ddH2O 225ml 。 9、脱色液: 甲醇、冰醋酸、ddH2O 以3 ∶1 ∶6 配制而成。 二、操作步骤 采用垂直式电泳槽装置 （一）聚丙烯酰胺凝胶的配制 1、 分离胶(10%)的配制: ddH2O 4.0ml 中国试剂网 3.9.101 30%储备胶 3.3ml 1.5M Tris-HCl 2.5ml 10% SDS 0.1ml 10% AP 0.1ml 取 1ml 上述混合液,加 TEMED(N,N,N’,N’- 四甲基乙二胺)10 μl 封底,余加 TEMED 4 μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。（凝胶完全聚合 需30-60min ） 2 、 积层胶 （4% ）的配制： ddH2O 1.4 ml 30%储备胶 0.33 ml 1M Tris-HCl 0.25 ml 10%SDS 0.02 ml 10%AP 0.02 ml TEMED 2 μl