凝胶过滤色谱.PDF

活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions 凝胶过滤色谱 凝胶过滤色谱蛋白纯化法 ，又称为空间排阻色谱 ，分子筛等。其原理是应用蛋白质分子量或分子形状的差异来分离。 当样品从色谱柱的顶端向下运动时 ，大的蛋白质分 子不能进入凝胶颗粒从而被迅速洗脱 ；而较小的蛋 白质分子能够进入凝胶颗粒中 ，且进入凝胶的蛋白 在凝胶中保留时间也不同 ，分子量越大 ，流出时间 就越早 ，最终分离分子大小不同的蛋白质。 通常 ，多数凝胶基质是化学交联的聚合物分子制备 的 ，交联程度决定凝胶颗粒的孔径。常用的色谱基 质有 ：葡聚糖凝胶 （Sephadex ）、琼脂糖凝胶 （Sepharose ）、聚丙烯酰氨凝胶 （Bio-Gel P ）等。高度交联的基 质可用来分离蛋白质和其他分子量更小的分子 ，或是除去低分子量缓冲液成分和盐 ，而较大孔径的凝胶可用于蛋白 质分子之间的分离。选用合适孔径的凝胶很大程度取决于目标蛋白的分子量和杂蛋白的分子量。 实验方案设计 1. 凝胶介质的选择 凝胶介质的选择主要是根据待分离的蛋白和杂蛋白的分子量选择具有相应分离范围的凝胶 ，同时还需要考虑到分辨 率和稳定性的因素。比如 ，如果是要将目的蛋白和小分子物质分开 ，可以根据他们分配系数的差异 ，选用 Sephadex G-25和 G-50 ；对于小肽和低分子量物质的脱盐 ，则可以选用 Sephadex G-10、G-15以及 Bio-Gel P-2或 P-4 ； 如果是分子量相近的蛋白质 ，一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。具体凝胶过滤色谱介质应用 如下 ： 常用凝胶过滤色谱介质的分离范围 凝胶介质 蛋 白质 的 分 离 范 围 凝胶介质 蛋 白质 的 分 离 范 围 /103 /103 Sephadex G25 1~5 Sepharose 2B 70~40000 Sephadex G50 1.5~30 Bio-Gel P-4 0.5~4 Tel 025 5889-4959 www.DetaiB Order@DetaiB ： （ ） 活性蛋白整体方案 Active Protein Solutions Sephadex G100 4~150 Bio-Gel P-10 5~17 Sephadex G200 5~600 Bio-Gel P-60 30~70 Sepharose 6B 10~4000 Bio-Gel P-150 50~150 Sepharose 4B 60~20000 Bio-Gel P-300 100~400 2. 凝胶介质的预处理 凝胶在使用前应用水充分溶胀 （胶 ：水=1 ：10 ），自然溶胀的耗时较长 ，可采用加热的方法使溶胀加速 ，即在沸 水浴中将凝胶升温至沸 ，1~2h即可达到溶胀。在烧杯中将干燥凝胶加水或缓冲液 ，搅拌 ，静置 ，倾去上层混悬液 ， 除去上清液中的凝胶碎块 ，重复数次 ，直到上清澄清为止。 3. 色谱柱的选择 色谱柱的体积和高径比与色谱分离效果密切相关 ，凝胶柱床的体积、柱长和柱的直径以及柱比的选择必须根据样品 的数量 ，性质和分离目的进行确定。组别分离时 ，大多采用 2~30cm长的色谱柱 ，柱床体积为样品溶液体积的 5 倍以上 ，柱比一般在 5~10 之间 ；而分级分离一般需要 100cm左右的色谱柱 ，并要求柱床体积大于样品体积 25 倍以上 ，柱比在 20~100之间。 4. 凝胶柱的填装 凝胶色谱柱与其它色谱方法不同 ，溶质分子与固定相之间没