在细胞发育过程中.PPT

5、DNA片断原位标记 1993年Wifsman等提出DNA片断末端标记法， Fehsel等1994年提出原位缺口转移检测细胞凋亡的方法。这些方法的提出把凋亡研究带进了新阶段，特别是这些技术发展为原位凋亡检测试剂盒，早期凋亡的检出TUNEL。 缺点: (1)坏死细胞亦有DNA 裂点形成，也可呈现TUNEL反应阳性， 因而特异性较差。 (2)TUNEL结合免疫组化检测时， 固定过程对检测的影响较大， 切片的大小、薄厚会直接影响到固定效果， 从而产生结果的差异。 Tunel反应：探针＋靶核酸 DNA-DNA 为间接法 杂交体 探针 半抗原标记物 标记探针 靶核酸 杂交体 酶标特异性抗体 显色 间接法原位杂交示意图 DAB 镜下控制 显色 水洗 75％酒精 85％酒精 95％酒精 无水酒精 （Tunel检测法） 灌注固定大鼠肝，Tunel反应阳性，DAB显色，血管内无红细胞背景染色。×125 非灌注固定大鼠肝，Tunel反应阳性，肝细胞核BCIP/NBT显色呈紫黑色，血管内红细胞呈桃红色。 ×250 RNA酶(RNase)保护实验 这种高度敏感的实验技术来源于对某些噬菌体的DNA依赖性RNA聚合酶的研究， 这种酶是从DNA模板上合成高度特异性RNA探针的理想工具， 用来检测和定量研究mRNA。这样， cDNA片断可以被克隆到含有噬菌体引物的质粒中， 并可用来合成放射性标记的反义RNA探针。 应用人类凋亡模板试剂盒中32P标记的反义RNA探针与从标本中分离的RNA 杂交， 再行RNA酶处理。最后用放射自显影或吸光度分析法分析翻译产物。此实验的优点是敏感性高， 可在一份总的RNA 标本中同时定性不同种类的mRNA 用RT-PCR 方法进行mRNA 的半定量分析 提取细胞的RNA ， 与逆转录酶、RNA酶抑制剂(RNA sin) 和dNTP孵育合成cDNA， 然后在特异性cDNA引物诱导下进行PCR反应， 最后琼脂糖凝胶电泳测定PCR 反应产物的大小。实验的灵敏性很高， 但是对于细胞组成不单纯的组织或细胞悬液说来， 不能确定与凋亡相关基因的mRNA来源于哪类细胞， 所以还应当进行蛋白表达的研究。 截止目前为止，凋亡检测的方法已有许多种，但任何一种方法都有自身的缺点和应用的局限性，影响检测结果的判断和意义分析。如果需要解决这些问题，在检测中已测出有凋亡发生时，如何解释结果？如何与疾病和肿瘤的发生发展联系起来呢？ ①首先我们必须建立正常时该体系的凋亡状态，正常对照组，以判断检测组凋亡是生理性，还是病理性。 ②同时检测该体系细胞增殖状态，对照该体系的增殖指数和凋亡指数，以判断该体系细胞周转率。 ③建立致病因素对被测体系影响的对照组，确定该致病因素与被测体系细胞增殖、凋亡的相关性（对照组的控制）。 ④如何定量与排除其它干扰。 十一、凋亡的生物学意义 细胞凋亡是生物体内无用的、老化的、或一些损伤的细胞死亡的一种形式，不引起局部组织损伤或炎症反应，主要意义在于生物进化的需要。竞争性的选择机制，是保证个体发育、成熟、和维持正常生理过程所必需。 1、清除多余的细胞 2、清除无用的细胞 3、清除有害的细胞 4、清除衰老的细胞 5、有选择性地清除细胞 十二、存在的问题与展望 虽然发现细胞凋亡的现象已经近40年，但人们真正认识到其重大的理论和实际意义，还是近几年的事。细胞凋亡分子机制的研究说明细胞的凋亡过程是受基因调控，是主动连续的程序化反应，在细胞凋亡研究中还有许多关键问题末解决。 1、在细胞发育过程中 ①细胞凋亡究竟是何时，又是如何开始的？（时间与方式）； ② 机体是如何决定一个细胞将要走向死亡的 ； ③ 在细胞有丝分裂和成熟之间有没有能激活细胞凋亡的开关点基因（Switch point gene）存在？ 2、机体内有没有真正的杀手基因（Killer gene）存在? 死亡相关基因是如何调控的？ 3、细胞凋亡究竟是通过哪些信号传导途径起作用？ 4、哪些疾病与细胞凋亡规律失常有关？ 能否通过调控细胞凋亡来达到治疗目的？ 5、细胞凋亡与衰老的关系如何？ 是否有活命基因（survival gene）的存在? 如果能发现凋亡特异性的基因或其产物，或其他特异性的标志物，就可能成为检测凋亡的指标。目前对凋亡的认识是一个连续的过程，进一步