用遗传学与生理学相结合的方法研究氨基酸生产.ppt

2002年春 张星元：发酵原理（讲座） 2002年春 遗传学和生理学结合的方法研究氨基酸生产 张星元：发酵原理（讲座） 用遗传学与生理学相结合的方法研究氨基酸生产  在进行包括输送途径的代谢流量的详细分析时，特别是在比较野生株和生产菌株，或特定菌株在生产或非生产条件下的性质时，已引出了几个重要的概念。 单靠“ 瓶颈 ” 酶的过量表达并不能获得理想的高产结果：在通常情况下，仅仅是从基质到产物整条途径的某 “ 瓶颈 ” 酶的过量表达并不能获得理想的高产结果。对生产菌株的分析表明，为了使得特定氨基酸能够稳定而有效地分泌，应该对酶和途径进行细致的调整。只有当一系列酶发生了协调的改变，才能避免细胞内代谢中间产物库的亏空或积压，避免代谢不平衡或不必要的副反应。 用谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌和酵母菌进行了有关芳香族氨基酸的成功的研究。关于谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌的代谢途径工程研究的成果已见发表。 为提高色氨酸的产量，已对谷氨酸棒杆菌按部就班地进行了一系列的遗传调节，包括：色氨酸操纵子（已被解除调节的）的基因的过量表达、去除调节子及弱化序列的控制；切断通往苯丙氨酸和酪氨酸的支路、增加前体物如 PEP、E-4-P和丝氨酸等的供应、破坏色氨酸酶的降解色氨酸的活性等等。 虽然一般用于芳香族氨基酸生产的微生物并不是酿酒酵母，但在概念探讨方面，用酵母进行的色氨酸生物合成的研究是引人关注的。实验结果表明，即使在无分支的途径中，想靠单个酶 “上调（up-modulation）”，增加整条途径的流量往往是无济于事的。 正如基于流量控制理论的理论解释，只有几种酶活性协同地提高，才有可能大幅度增加流向色氨酸的全程的流量。这个发现为许多途径中的关于“分摊式的代谢控制（distributive metabolic control）”的更加笼统的描述提供了支持；同时也对仍在广泛使用的代谢途径的所谓“瓶颈”识别方法做出了一个重要的限制。 4.??? 氨基酸生产的代谢设计 氨基酸生产上广泛使用棒状杆菌，这一方面有历史的原因；另一方面，与其他微生物如大肠杆菌相比较，棒状杆菌在工业生产上具有明显的优势。 针对于不同的目的和不同水平的复杂性，在考虑代谢设计的策略时应区别对待。 代谢设计的目标在于： （1）提高已建立的途径或过程的效率； （2）将代谢流导向至新插入的途径。 第一个目标可通过多种手段来实现： ①扩展基质利用的范围 ②改善生长条件； ③增大通往特定氨基酸合成途径的代谢流； ④调大通往目的产物的支路和调小通往副产物的支路。 十多年前，曾有人做过把谷氨酸棒杆菌中碳架流导向苏氨酸的开创性研究，其方法是扩增苏氨酸合成途径起始端的两个酶高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶的基因（hom 和 thrB ）， 以及解除对高丝氨酸脱氢酶的反馈调节。 最近有一项有启发性的研究将一株赖氨酸的生产菌株（出发菌株）逐步转变为苏氨酸生产菌株，其方法是将突变株的 hom - thrB 操纵子（指为已解除调节的高丝氨酸脱氢酶和高丝氨酸激酶编码的操纵子）不同拷贝数整合到出发菌株的染色体DNA上。 尽管出发菌株可有效地分泌赖氨酸及少量的甘氨酸，但当整合到染色体 DNA 上的 hom-thrB操纵子的拷贝数为1～3时，苏氨酸的分泌量则显著增加，同时赖氨酸的产量则下降了原来的四分之一。 如果以该苏氨酸生产菌株作为出发株，也同样可采用类似的策略将解除调节的苏氨酸脱水酶和乙酰羟酸合成酶（从苏氨酸到异亮氨酸的合成途径的第一和第二个酶）引入异亮氨酸的合成途径。 以前，此类研究的主要目标就是鉴别被认为必须改变或绕过的所谓的 “ 瓶颈反应 ”。对于第一步反应受到反馈调节的某些合成途径，这一方法的确有效。并且，这一方法是运用代谢撷颃物（如合成途径的终端产物氨基酸的结构类似物）成功地实现育种策略的基础。这些代谢撷颃物的抗性突变株的突变，常常是发生在一个反馈调节的主要反应步骤（一般被叫做“代谢瓶颈”）所对应的基因上。 最典型的例子当属针对谷氨酸棒杆菌赖氨酸合成途径中的天门冬氨酸激酶的工作。赖氨酸生产菌种一般是赖氨酸的结构类似物AEC（aminoethyl cystein）的抗性突变株。 然而分子水平的实验证实，即便是在这种情况下，这种简单的方法仍不能导致赖氨酸的高效合成。显然，通过随机诱变和筛选所得到的