Western blot 技术-详细版医学课件.pptVIP

Western blot 实验技术 * 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 * Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 快速、特异，信号弱、昂贵 信号强、二抗选择多，非特异性结合 * Western Blot一般流程 SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的制备 * 蛋白样品的制备 * 裂解液 只能识别非变性的抗原表位的抗体，不能选择SDS及强去污剂的裂解液 研究蛋白之间相互作用，应选择温和非变性裂解液 对于难溶解蛋白，应选用裂解强度更高的裂解液（如RIPA, SDS) * SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子