基于质谱的蛋白质组学分析.pptVIP

01 TOF 离子在离子源里产生，在电压为V的电场作用下加速，飞过漂移区后到达检测器内，这段飞行时间为其在加速区中飞行时间和漂移区的飞行时间之和，正比于其质量的平方根 离子阱的上下端罩与左右环电极构成可变电场，带电离子在一定轨道上旋转，改变电压可使相同m/z离子依次离开进入电子倍增器而分离 03 Q 样品离子沿电极间轴向进入电场后，在极性相反的电极间振荡，只有质荷比在某个范围的离子才能通过四级杆到达检测器，其余离子因振幅过大与电极碰撞，放点中和后被抽走 02 IT 04 FT-ICR 离子在磁场作用下成为回旋离子，离子回旋时吸收与磁场垂直的电场能量，当离子能量和吸收能量相等时产生共振，此时切断交变电场，回旋离子在电极上产生感应电流，感应电流随时间衰减，记录该信号并通过傅里叶变换将时域图转换为频域图（质谱图） MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤 2.样本被激光电离形成多肽 离子混合物 Pulsed laser 3.多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度取 决于多肽离子的M/Z的大小 1.基质与多肽样本共同 置于刚靶上 5.检测到每个离子的M/Z后，同一张图谱上计算机输出每个肽段M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白 4.到达检测器的离子，通过检测器检测出每个肽段离子的M/Z Tim e Flight tube High vacuum High voltage 20 - 25 kV 现在生物质谱主要在蛋白质组学研究中承担以下任务： （1）通过精准的质量分析器来测定蛋白质的准确分子量或检测肽指纹谱 （2）通过CID、CAD、PSD等串级方式对肽段进行序列测定 （3）对蛋白质巯基及二硫键进行定位 （4）对蛋白质翻译后修饰状况进行定位 （5）检测生物分子相互作用及非共价化合物 生物质谱在蛋白质组学研究中的利用 1.蛋白质的定性分析 依据分析对象是整体蛋白质混合物或酶切后的多肽混合物，蛋白质组的定性分析方法分为自下向上法（bottom?up，针对多肽混合物）和自上向下法(top?down，针对整体蛋白质混合物)。? ???? 依据蛋白质数据库中是否存在所鉴定的蛋白质，蛋白质组的定性分析方法进一步分为：对蛋白质数据库中含有待鉴定的蛋白质，包括：肽质量指纹谱法（PMF，适合于简单蛋白质混合物)；肽序列标签法（PST，适合于复杂蛋白质混合物）?。对蛋白质数据库中不存在待鉴定的蛋白质，采用从头测序法（de?novo）? Schematic showing the top-down and bottom-up approaches to protein analysis and identification. In the top-down approach, the intact protein is fragmented in the gas-phase to create sequence-specific fragment ions to aid in sequence analysis. The bottom-up approach uses proteolytic enzymes to create peptides for sequence analysis usually by using multidimensional liquid chromagoraphy in combination with tandem mass spectrometry 自顶向下策略是以蛋白质分子整体作为分析对象，通过蛋白质的肽质量指纹（peptide?mass?fingerprinting,PMF）对蛋白进行鉴定的方法。为了有效地克服质量简并的现象，减少搜索目标的范围，一般选择高精度和高分辨率的质谱，如傅里叶变换离子回旋共振质谱仪（2ppm，50000）。该策略具有较高的序列覆盖度和翻译后修饰特征的保持，适合于翻译后修饰及特殊的蛋白质异构体的分析。不足的是，(1)实验样品蛋白质需要高度纯化；(2)在目前的实验条件下，较难分析大分子量的蛋白质。? 自底向上策略,?称之为鸟枪法,?是利用串联质谱数据，即肽碎片指纹（peptide?fragment?fingerprinting，PFF）来鉴定肽段序列，然后再推断组装样品中包含的蛋白质,?是常用的高通量分析策略。由于肽碎片携有呈几何增长的组合信息，可以消除质量简并之忧，对质谱的质量分辨率要求不高，多用于对复杂样品的混合物进行高通量分析。 成功鉴定 样品 酶解 酶解片断 一级质谱 PMF 肽指纹图谱 串联质谱 对库 检索 序列数据库 PSMs及后筛选 De-novo 序列分析 未知蛋白 蛋白质鉴定流程 定性蛋白组学实验平台 2.蛋白质的定量分