内标基因的相对表达量.DOCVIP

现在的文献一般写有两种相对定量的方法，一种为2－△△Ct法，另一种是相对标准曲线法。 2－△△Ct推导过程 假设有未处理样品标为0、处理样品标为1；目的基因标为m、内标基因标为n 这样，未处理样品中目的基因的拷贝数为Xm0、内标基因的拷贝数为Xn0; 处理样品中目的基因的拷贝数为Xm1、内标基因的拷贝数为Xn1; 目的基因的扩增效率Exm、内标基因的扩增效率Exn 一定阈值下得到的未处理样品中目的基因的Ct值为Ctm0、内标基因的Ct值为Ctn0; 一定阈值下得到的处理样品中目的基因的Ct值为Ctm1、内标基因的Ct值为Ctn1; 根据PCR反应动力学公式： E = X0*(1+Ex)n + Eb (Eb为荧光背景值，E为n次循环对应的荧光强度)，在给定阈值的前提下，我们不难得出下面两式： （1） Xm1*(1+Exm)Ctm1 = Xm0*(1+Exm)Ctmo （2） Xn1*(1+Exn)Ctn1 = Xn0*(1+Exn)Ctno （这两个公式忽略了荧光背景值：我们检测的并不是拷贝数，而是与拷贝数相对应的荧光信号。因为未处理样品与处理样品的荧光背景肯定会不同） 两式相除得： （3） (Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0) = (1+Exm) Ctm0-Ctm1/（1+Exn）Ctn1-Ctn0 如果目的基因扩增效率与内标基因扩增效率相同，即Exm＝Exn＝E＝100％ 则： (Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0)＝2－△△Ct 从以上推导过程可以看出： 此法忽略了荧光背景、目的基因与内标基因扩增效率不同并不可能为100％这两种情况所造成的影响。 相对标准曲线法 根据人为确定的目的基因和内标基因的拷贝数进行倍比稀释，来得出它们各自的标准曲线。之后按照样品的Ct值在标准曲线上作一对应算出拷贝数，两者相除分别得到得到两个不同样品中目的基因的相对表达量、内标基因的相对表达量。然后再将两者相除，得到目的基因相对于内标基因的表达差异值。 此方法的原理也可从上面的公式推导出来： （1）式两边相除为 Xm1/Xm0 =（1+Exm）Ctm0-Ctm1（由目的基因的相对标准曲线可算出Xm1/Xm0具体值） （2）式两边相除为 Xn1/Xn0 = (1+Exn) Ctn0-Ctn1 （由内标基因的相对标准曲线可算出Xn1/Xn0具体值） 两式相除即可得出(Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0)值，由此可以看出相对标准曲线法并没有忽略目的基因与内标基因扩增效率之间的差异，只是忽略了荧光背景值不同而造成的影响。 总结 事实上，任何相对定量方法都万变不离其宗： 公式（3） (Xm1/Xn1)/(Xm0/Xn0) = (1+Exm) Ctm0-Ctm1/（1+Exn）Ctn1-Ctn0