体内药物分析常用生物样品处理方法和方法学验证 课件.ppt

有机溶剂应选择稳定，易挥发，低毒性，不与水相混溶的溶剂。常用的有机溶剂有：乙醚、乙酸乙酯、正己烷、叔丁基甲醚和氯仿等。 应用本法时需要考虑所选有机溶剂的特性、药物的特点、有机溶剂相和水相的体积比及水相的pH值等。 酸性药物的解离：AH + H2O A- + H+ 碱性药物的解离：B + H2O B+ + OH- 药物的解离常数pKa为药物解离50%时溶液的pH值。 * ppt课件 药物的提取程度主要取决于水相的pH值。对于碱性药物，最佳pH值要高于pKa 1-2个单位；对于酸性药物来说，则要低于pKa值1-2个单位；这样就可使90%的药物以非电离的形式存在从而更易溶于有机溶剂中。 常用来调节pH值的物质有：甲酸、乙酸、盐酸 或 氨水、氢氧化钠等。 水相的PH值--影响液液萃取最关键的因素 * ppt课件 具体的提取模式有两种，直接提取和反提取法。 优点：样品经过提取后，可除去大部分杂质，比较“干净”；对有机溶剂蒸发后复溶，可以对样品进行浓缩；大多数药物具有脂溶性，应用范围广。 缺点：费时费力，操作繁琐；且对血浆进行提取时，血浆中的脂质会一起被提取出，当使用质谱检测器时，会在离子源处产生基质效应，严重干扰质谱检测结果的准确性！ * ppt课件 方法摸索中，一般是使用以上溶剂，平行操作，同时提取，附加空白对照，比对结果，判断哪种有机溶剂的提取效果最好； 若均不理想，可以再混合使用以上溶剂，调整比例1:1 ,1:2 ,1:3的使用； 在摸索合适的提取溶剂同时，可根据药物的酸碱性尝试着添加些酸、碱或者离子对试剂，提高回收率； 提取过程中，一定要严控pH值，对于两性药物则需要使用缓冲溶液保证提取回收率的稳定可重现。 * ppt课件 举例：雌二醇的检测 取血浆样品100uL，+同位素内标20uL，+甲酸50uL，+正己烷1mL+叔丁基甲醚3mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80℃冷冻10min，倒出上层有机层，40℃水浴氮气吹干，+150uL丙酮溶解，+50uL丹磺酰氯丙酮溶液，40℃水浴孵育20min，+磷酸盐缓冲液2mL+叔丁基甲醚4mL，涡旋震荡10min，3000r/min离心10min，-80℃冷冻10min，倒出上层有机层，40℃水浴氮气吹干，流动相复溶。 * ppt课件 固相萃取(Solid Phase Extraction，简称SPE)是从八十年代中期开始发展起来的一项样品前处理技术。由液固萃取和液相色谱技术相结合发展而来。主要通过固相填料对样品组分的选择性吸咐及解吸过程，实现对样品的分离，纯化和富集。主要目的在于降低样品基质干扰，提高检测灵敏度。 3.固相萃取 SPE * ppt课件 固相萃取的基本原理和方法： SPE 技术基于液-固相色谱理论，采用选择性吸附、选择性洗脱的方式对样品进行富集、分离、纯化，是一种包括液相和固相的物理萃取过程；也可以将其近似地看作一种简单的色谱过程。 较常用的方法是使液体样品通过一吸附剂，保留其中被测物质，再选用适当强度溶剂冲去杂质，然后用少量良溶剂洗脱被测物质，从而达到快速分离净化与浓缩的目的。也可选择性吸附干扰杂质，而让被测物质流出。 * ppt课件 * ppt课件 萃取小柱一次性使用，防止交叉污染！ * ppt课件 固相萃取操作一般有五步： 活化——甲醇/乙腈 润湿小柱，活化填料； 平衡——水或适当缓冲液冲洗平衡小柱； 上样——将样品转移上柱，抽去废液； 淋洗——水或缓冲液最大程度洗去干扰物； 洗脱——用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。 * ppt课件 1.正相色谱原理 2.反相色谱原理 3.离子交换原理 根据原理分类： * ppt课件 * ppt课件 SPE方法的优点： 1.不会发生乳化；2.适用范围广；3.提取效率高； 4.方便快速，可以一次提取分离多种化合物； 5.溶剂消耗少；6.易于实现自动化； 7.离子交换固相萃取利用离子交换原理，同色谱柱的依据极性大小的分离原理不同，配合使用，可以最大限度的分离出药物，去除干扰。 目前商品化的固相萃取小柱（cartridge）已经广泛应用。 * ppt课件 三种方法的比较： * ppt课件 将药物进行化学衍生化的目的是：①使药物变成具有能被分离的性质；②提高检测的灵敏度；③增强药物的稳定性；④提高对光学异构体分离的能力等。 药物分子中含有活泼H者均可被化学衍生化，如：-COOH、-OH、-NH2、-NH-、-SH等官能团的药物都可被衍生化。 4.化学衍生化法 * ppt课件 HPLC中化学衍生化法，包括柱前衍生化和柱后衍生化两种方法。 柱前衍生化分析前尽可能将药物进行提取分离后再衍生化，防止其他含有相同的功能基团的杂质也被衍生化，影响分离。柱后衍