基于表达序列标签的玉米单核苷酸多态性标记开发-作物遗传育种专业论文.docxVIP

论文独创性声明 本人声明，所虽交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表戒撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其他教育机构的学位或证书 所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均巳在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研时名:如 时间户户年(月沪包 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即 t 学校有权保留 并向国家布关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，?lJ以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不 问方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 唰 喇喇nRM川川川 唰 喇喇nRM 川川川 A崎 川川川川nu 恻唰唰唰A1 唰川州hu 川川川川00 - . 川配UUVAE my 导师俗易比打J  时间:(} (IJ 年 6月 3白 时间:;}9( tJ 年 6月y日 摘要 单核昔酸多态性( Single Nucleotide Polymo叩his叽 SNP) 是由单碱基颠换、转换、 插入或缺失引起的 DNA 序列变异。与限制性片段长度多态性 (Restriction Fra阴ent Length Polymorphism ，R阻的和简单重复序列 (Simple Sequence Repeat ，SSR) 等常 用分子标记相比， SNP 具有分布密度高、遗传稳定、与表型性状相关性强、检测简便、 易于实现自动化分析等诸多优点，被称为第三代分子标记。针对 SSR 分子标记密度 不足， 现有的 SNP 分子标记开发…般只幕于两种基因型的序列差异，用以检测其他 基因型的材料时多态性不高，不能满足目前玉米基因精细定位需要的现状，本研究从 公共数据库下载来自不同遗传背景的玉米表达序列标签 (Expressed S叫uence Tag， EST) ，运用各种生物信息学软件和自主编写的程序，开发基于EST 序列的 SNP 分子 标记，并通过高分辨率烙解 (High Resolution Melt ，HRM) 技术验证部分标记的多态 性。 以生物倍息学理论为基础，利用 Bl协ωt队、 Cαroωss_ 和自主开发的阳Pe创rl 脚本程序，基于 WindowsXP 和 Linux 操作系统构建数据分析系统， 并使用 Perl 语育结合 Bioperl 模块编写的脚本程序让整个分析过程自动化，使 ES丁数 据得到快速、有效的分析。该数据分析系统完成了 EST 序列聚类，载体序列、低质 量序列和重复序列的去除， EST 序列拼接，制P 位点的发掘， PCR 引物的设计和筛 选， SNP 分子标记定位以及多态性信息含量 (Polymorphism Information Content ，PIC) 计算。 通过对 2018530 条玉米 EST 序列的聚类与拼接发掘出遍布全基因组的 80363 个 SNP 位点。在 SNP 优点两侧的保守序列上设计 PCR 引物，开发出 12388 个 SNP 分 子标记，包含 34721 个 SNP 位点， 12762 个位点的多态性信息含量 (PIC) 大于 0.4， 具有高度多态性。其中， 6008 个标记只含单一的 SNP 位点.根据 SNP 标记所在 B73 自交系基因组 BAC 序列在染色体上的位置， 12117 个标记可定位于玉米的 10 条染色 体上，以第 1 染色体上的标记最多。并基于 Microsoft Windows XP 操作系统，利用 Adobe Dreamweaver 等软件在四川农业大学玉米研究所网站上建立标记公共数据库 的静态平台 ( HYPERLINK lweb/yms/snp/snp.html) lweb/yms/snp/snp.html) ，所布SNP 分子标记及相 关信息可登录该网页查阅。 从所开发的 SNP 分子标记中随机挑成 9 对标记引物，以 46 个玉米自交系的为材 11 11 料，根据差异核昔酸高分辨率熔解曲线形状的不间，利用 HRM 技术对加有饱和荧光 染料的实时定量 PCR 扩增产物进行基因分型来验证 SNP 的多态性。荧光值兼异曲线 显示t 在有荧光信号的自交系中， 9 对引物的 PCR 产物都被 HRM 分型，表现出多态 性，附和 P6 出现两种基因型，其余引物都显示出 3 种基因型， SNP 检测率为 1ω%0 熔解峰显示:对于有倍号的自交系， 9 对引物的 PCR 产物熔解峰都为单一峰，无非 特异性扩增及引物二聚体产生，且峰值相近，说明这些引物的特异性高较好.由于